Экспрессия генов в ткани: теперь с микроскопическим разрешением

Функции сложных тканей тесно связаны с пространственной организацией образующих их клеток. Однако до сих пор не существовало метода получения данных об экспрессии генов с разрешением, сопоставимым с размерами отдельных клеток, который бы отражал их положение в ткани. С помощью мультиплексной гибридизации in situ (Single-molecule RNA FISH) и основанных на секвенировании методов можно определять экспрессию на внутриклеточном уровне, но необходимо заранее выбрать анализируемые гены, а разрешение технологий секвенирования РНК с помощью баркодированных олигонуклеотидов ограничено сотнями микрометров, что недостаточно для выявления важных особенностей тканей.

Ученые из Института Брода МТИ и Медицинской школы Гарвардского университета разработали более чувствительный метод под названием Slide-seq. На стекло с резиновым покрытием наносят частицы диаметром 10 мкм с закрепленными на них уникальными баркодированными олигонуклеотидами (на одной частице закреплены молекулы ДНК с одним и тем же баркодом). Секвенирование баркодов (то есть определение положения частиц) выполняется по технологии SOLiD. Затем на стекло переносят замороженный срез ткани толщиной 10 мкм, и тканевые мРНК иммобилизуются на частицах подложки. С помощью обратной транскрипции и амплификации получают библиотеку РНК. Секвенирование и последующая обработка результатов дает картину экспрессии, отражающую положения тех или иных клеток, с отдельными данными для сотен тысяч точек. Эта картина более информативна, чем стандартные микроскопические изображения.

Технология была испытана на фронтальном срезе гиппокампа мыши, где удалось увидеть даже однослойную эпендиму, а также на мозжечке, обонятельной луковице, печени и почках. Полученные для мозжечка мыши паттерны экспрессии генов показали, что многие клетки, в частности, клетки Пуркинье, глия Бергмана и гранулярные клетки, образуют пространственно обособленные субпопуляции.

Во всех случаях расположение типов клеток было определено с хорошим разрешением, данные об экспрессии генов согласовывались с уже известными, и полученные таким образом пространственные структуры не отличались от тех, что были выявлены с помощью флуоресцентной гибридизации in situ.

Ученые также применили Slide-seq для анализа реакции мозга мыши на травму. Через три дня на месте травмы были обнаружены клетки микроглии и макрофаги, окруженные слоем клеток, экспрессирующих митоз-ассоциированные факторы, и астроцитами. Через две недели клетки микроглии и макрофаги заполнили повреждение, и их по-прежнему окружали астроциты, причем клетки микроглии (но не макрофаги) проникали через слой астроцитов в участки с большим числом нейронов. Анализ показал, что через три дня в районе травмы активно экспрессировались гены, связанные с сегрегацией хроматид, митозом и делением клеток, а через две недели — связанные с иммунным ответом, глиогенезом и развитием олигодендроцитов. Следовательно, пролиферация клеток происходит в первые дни после травмы, а переход к дифференциации — в течение недель.

Результаты исследования подтвердили, что метод Slide-seq позволяет проводить пространственный анализ экспрессии генов на обширных участках замороженных тканей, причем с высоким пространственным разрешением и по доступной цене — сотни долларов за эксперимент. Его можно использовать для выяснения расположения молекулярно определяемых типов клеток в сложных тканях и изучения молекулярных путей, вовлеченных в нейропатологические состояния. Возможно, в дальнейшем, по мере уменьшения цены секвенирования, Slide-seq будет применяться для анализа целых органов или даже организмов.