Направленная эволюция редакторов оснований повысила их эффективность

В последние годы появляются все новые модификации системы CRISPR/Cas, которые заменяют только одно основание в последовательности ДНК или РНК без внесения двунитевого разрыва — редакторы оснований (BE, от base editor). Вместо обычной нуклеазы Cas9 при этом используют «мертвую» (dead) Cas9, или dCas9. Замену оснований осуществляют специальные ферменты. Например, цитидин-деаминаза (rAPOBEC1), пришитая к N-концу dCas9, превращает цитозин ДНК в урацил; клеточные системы репарации заменяют его на Т, так что в итоге получается замена пары GC на AT. Кроме цитозиновых редакторов, существуют и адениновые, которые проводят обратное превращение. Над созданием новых редакторов оснований активно работают в лаборатории Дэвида Лю.

Эффективность редактирования сильно зависит от контекста, в котором находится нуклеотид-мишень; например, замены осуществляются только в центре рамки редактирования, находящейся на определенном расстоянии от PAM — короткого участка, необходимого для связывания CRISPR. Есть и другие ограничения, например, плохое распознавание C в мотиве GC. Повысить эффективность редактирования исследователям из Института Брода помог метод фагово-опосредованной непрерывной эволюции (phage-associated continuous evolution, PACE).

Нобелевская премия по химии в 2018 году была присуждена за разработку метода фагового дисплея. Ген интересующего белка встраивается в ген оболочки нитчатого бактериофага, так что экспрессируемый белок оказывается на его поверхности. Размножение фага и мутации в гене создают разнообразие белков, и в популяции фагов можно отобрать те, что несут белки с желаемыми свойствами (например, эти белки хорошо связываются с молекулой-мишенью на подложке). Одновременно мы получим и ген белка, который находится внутри фага. Несколько раундов такой искусственной эволюции могут существенно улучшить свойства белка.

Метод PACE работает иначе: эволюционирует более сложная функция белка, чем связывание с мишенью, и отбор ведется по-другому. В колбе с фиксированным объемом, которую исследователи называют «лагуной», обитают бактериофаги M13, кодирующие нужные белки, и хозяева фага — кишечные палочки. Каждый фаг несет ген эволюционирующего белка (в данном случае — фермента, который редактирует основания) вместо гена III, который необходим для инфицирования кишечной палочки; без продукта гена III фаг не может покинуть клетку. Этот ген перенесен во вспомогательную плазмиду, которая содержится в клетке-хозяине. И самое главное — экспрессия гена III зависит от активности эволюционирующего белка. Например, в модифицированный фермент, редактирующий цитозин, вносит замену в последовательность белка-супрессора, формируя стоп-кодон и таким образом снимая супрессию. Чем лучше происходит замена основания, тем активнее размножается фаг. Кроме того, в бактериальных клетках содержится плазмида с набором генов, способствующих мутагенезу в ДНК фага.

«Непрерывной» эволюция называется потому, что в «лагуну» постоянно поступают свежие клетки, которые фаги могут инфицировать, и в то же время из «лагуны» постоянно отбирают отработанную среду, в чтобы контролировать, насколько успешно идет эволюция. Поскольку полный цикл репликации фага длится всего 10 минут, PACE позволяет проводить сотни раундов направленной эволюции менее чем за неделю с минимальным участием исследователя — это в 100 раз быстрее, чем традиционные методы эволюции белков.

В работе, опубликованной в Nature Biotechnology, описаны несколько модифицированных цитозиновых редакторов семейства BE4-max, содержащих разные варианты деаминаз: evoAPOBEC1, evoFERNY и evoCDA1. Все три варианта обладают более высокой эффективностью по сравнению с нативными формами, например, evoAPOBEC1-BE4max исправляет цитозины в GC-контексте в 26 раз лучше, чем предковая форма. При этом evoFERNY-BE4max редактирует GC-пары еще эффективнее, поскольку деаминаза evoFERNY на 29% меньше, чем evoAPOBEC1; однако последняя показывает несколько лучшие результаты в не-GC-сайтах. EvoCDA1-BE4max в сайтах, для которых характерна в целом высокая эффективность редактирования, генерирует повышенное количество инсерций и делеций, а в сайтах с типично низкой эффективностью редактирования он показывает более высокую эффективность. В обоих случаях evoCDA1-BE4max показал высокие уровни нецелевого редактирования. В целом, по мнению авторов, для каждого из новых инструментов найдется своя область применения с учетом «технических характеристик».

Таким образом, «эволюционный» метод изменения белков, основанный на отборе случайных мутаций, служит созданию орудий для целевого редактирования — точечных изменений в определенных заранее местах.