Нокаут гена при помощи CRISPR-Cas9 не всегда подавляет экспрессию белка

Система CRISPR-Cas9 часто используется для нокаута генов. Она вносит двунитевые разрывы ДНК, починка которых клеткой путем негомологичного соединения концов нередко приводит к появлению вставок или делеций, сдвигающих рамку считывания. Секвенирование ДНК — это простой и быстрый способ показать, успешно ли была введена нокаутирующая мутация. Однако оно не показывает, действительно ли эта мутация выключила экспрессию белка.

Группа ученых из Европы и США проверила экспрессию 136 генов, в которые были введены 193 мутации, сдвигающие рамку считывания. Исследование проводилось на клеточной линии человеческого происхождения HAP1, почти каждая клетка которой содержит гаплоидный набор хромосом. Определив уровень экспрессии 174 мутантных белков с помощью секвенирования 3’-концов мРНК, ученые обнаружили, что остаточная экспрессия (отношение уровня экспрессии у мутантов к уровню экспрессии у нормальных клеток) во многих случаях была отлична от нуля. Несмотря на то, что мутантные мРНК в клетке должны подвергаться нонсенс-опосредованному распаду, их количество в среднем снизилось не намного, а в некоторых случаях даже возросло.

Еще более неожиданным оказался результат трибридной масс-спектрометрии (MS3) с изобарическими метками (TMT). Около трети мутантов продолжали синтезировать белки в количестве более 10% от количества соответствующего белка в нормальных клетках. При этом корреляции между уровнем экспрессии мРНК и количеством белка ученые не нашли. В поисках механизмов, позволяющих поддерживать синтез белка после нокаута, исследователи детально проанализировали клетки с мутантными белками MTF2, PI4KB и BRD3. Во всех трех случаях мутантный экзон вырезался при помощи альтернативного сплайсинга. У BRD3 мутация была внесена в первый экзон, но экспрессия продолжилась с других старт-кодонов. У MTF2 был вырезан пятый экзон, что привело к сдвигу рамки в шестом, но синтез нормального шестого кодона продолжился со старт-кодона в четвертом экзоне, чья рамка после делеции совпала с рамкой шестого. Вырезание пятого экзона у PI4KB не вызвало сдвига рамки считывания, но приводило к делеции внутри рамки.

Ученые обнаружили и другие механизмы, позволившие мутантным генам сохранять активность. Мутация во втором экзоне BRD4 привела к тому, что трансляция началась после нее, и полученный белок потерял N-концевой участок, но частично сохранил активность. В гене DMNT1 мутация была внесена в шестой экзон, что привело к синтезу двух пептидов: пептида из начальных экзонов, обрывающегося на появившемся в результате мутации стоп-кодоне, и пептида из восьмого экзона, чей старт-кодон, вероятно, расположен в невырезанном интроне перед восьмым экзоном.

Таким образом, сдвиг рамки считывания в гене после вмешательства CRISPR-Cas9 необязательно приводит к потере функции гена. Одно лишь секвенирование ДНК не может показать, насколько успешно прошел нокаут. Для точной оценки необходимо проверять количество белка методом масс-спектрометрии. Авторы надеются, что обнаружение механизмов, отвечающих за сохранение активности, поможет в поиске надежных сайтов для нокаута генов-мишеней.