Нобелевская неделя 2019. Питер Рэтклифф: «Если вы убиваете свое растение, сильно его поливая, то вы, возможно, убиваете его посредством гипоксии»

Перед началом своей лекции сэр Питер Рэтклифф поблагодарил Патрика Эрнфорса (Patrik Ernfors) за представление и Нобелевскую ассамблею за честь.

«Так как Грегг, Билл и я — англо-американское трио, я бы хотел начать эту лекцию с рассказа об англо-американской экспедиции на пик Пайкс (1911 год), штат Колорадо, целью которой было изучение адаптации к высотной гипоксии. Лидером экспедиции был Джон Скотт Холдейн (John Scott Haldane), но героиней этой лекции будет Мэйбл Фицджеральд (Mabel Purefoy FitzGerald) — единственная женщина в коллективе, которая не являлась членом Оксфордского университета из-за своего пола». Мейбл проводила свои исследования на промежуточных высотах и измеряла парциальное давление углекислого газа в альвеолах и концентрацию гемоглобина в крови в зависимости от высоты: «Это была демонстрация удивительной чувствительности системы регуляции в условиях гипоксии, что мы и будем сегодня обсуждать».

Ген эритропоэтина и его энхансер

Регулятором концентрации гемоглобина (количества эритроцитов) является эритропоэтин, который синтезируется в почках. В 80-е Питер как раз изучал нефрологию, и его заинтересовал вопрос: что является сенсором кислорода и стимулирует синтез эритропоэтина: «Мы думали, что найдем очень специфический сенсор в очень специфических клетках почек, которые измеряют количество кислорода и производят эритропоэтин. Проблема была в том, что их не обнаружили в почке, и мы не могли работать с удобной культурой клеток».

Группа Рэтклиффа нашла эти клетки в почках трансгенных мышей, у которых эритропоэтин экспрессировался совместно с SV40 T-антигеном. Антиген был маркером, и исследователи выявили группу клеток, синтезировавших эритропоэтин, которые оказались обычными межтканевыми фибробластами (Maxwell et al., 1993). Тем временем, группа Франклина Банна (Franklin Bunn) показала, что клетки гепатомы — опухоли печени — также синтезируют эритропоэтин в ответ на гипоксию в культуре (Goldberg et al., 1987).

И группа Рэтклиффа, и группа Семенцы пытались картировать регуляторные области гена эритропоэтина, чтобы понять работу сенсорного пути. Ратклифф с Кристофером Пью (Christopher Pugh) описали энхансер, лежащий рядом с 3′-концом гена Epo в клеточных линиях гепатомы (Pugh et al., 1991). Его наличие повышает экспрессию гена при низкой концентрации кислорода. Затем они трансфецировали другие клетки, нечувствительные к изменению кислорода, плазмидой с геном-репортером, связанным с описанным энхансером. Оказалось, что эти клетки также способны реагировать на снижение концентрации кислорода (Maxwell, Pugh, Ratcliffe, 1993). Возможно, в них сенсорная система регулировала другие гены, не Epo.

«Я был очень впечатлен работой, написал статью... Я повез рукопись в офис известного журнала в Лондоне. Моей целью было ворваться в офис, найти редактора: чтобы он сразу оценил значимость этой работы и согласился опубликовать ее... Вот что мы получили спустя четыре месяца: «...нам было очень сложно подобрать рецензента». Для молодых людей: если вам такое говорят, это хорошо, это значит, что вы в очень узкой области. Это облегчит вам жизнь».   

Регуляция работы HIF

«Грегг сделал великолепную работу, определив, что HIF связывается с нашей последовательностью (HRE — hypoxia response element). Мы встретились в отеле в Люцерне (Швейцария). Он выступил с неопубликованными данными про идентификацию HIF в клетках гепатомы, я презентовал работу, которую только что описал. Это мы, сосредоточенно обдумываем дальнейшие действия. По фотографии не скажешь, но этот отель был самым шикарным местом, где мы оба когда-либо были. И вряд ли побывали бы еще, если бы не приехали сюда».

После этого группа Рэтклиффа нашла другие гены, которые регулируются в ответ на снижение концентрации кислорода: кодирующие фосфоглицераткиназу 1 и лактатдегидрогеназу А — ферменты энергетического метаболизма, в частности — гликолиза (Firth et al., 1994). Также в клетках дрозофилы они описали HIF-подобные факторы, которые под действием гипоксии взаимодействуют с сайтами посадки HIF-1 (Nagao et al., 1996).

«Нам хотелось пойти вверх от HIF-1 по сигнальному пути... И мы хотели понять, что дает HIF-1 возможность быть чувствительным к кислороду». Так лаборатория Рэтклиффа совместно с другими коллективами обнаружила три регуляторных участка у HIF-1α. На тот момент уже было известно, что одним из способов передачи сигнала было фосфорилирование белков. Тем не менее, гипотезу о фосфорилировании HIF-1α опровергли: в одном из регуляторных участков аминокислоты, акцептирующие фосфат, не играют роли в активности белка.

Потом исследователи определили, что эти регуляторные последовательности HIF-1α взаимодействуют с белком VHL (Von Hippel–Lindau) (Maxwell et al., 1993). «Это был момент истины в нашей лаборатории. В клетках с мутацией в гене VHL количество HIF-1α не менялось. Но если вернуть им VHL, HIF-1α снова приобретает способность реагировать на гипоксию». Группа Уильяма Кэлина показала, что в клетках рака почки с мутацией в VHL HIF-1α также присутствует вне зависимости от концентрации кислорода.

HIF-1 имеет PAS домен, и в геноме человека нашли еще один белок с таким доменом, который мог являться паралогом HIF-1, и назвали его EPAS-1 (Endothelial PAS domain protein 1). «Нужны были антитела, чтобы подтвердить чувствительность EPAS-1 к кислороду. Патрик Максвелл (Patrick Maxwell) из нашей лаборатории сделал такие антитела, PM9 — Patrick Maxwell 9». Оказалось, что некоторые клетки синтезируют только EPAS-1, который назвали HIF-2.

Таким образом, VHL — убиквитин-лигаза, которая в присутствии кислорода связывает HIF-1 и отправляет его на деградацию в протеасомы. «Мы задались биохимическим вопросом: что в клеточном экстракте позволяет этим белкам связывать друг друга?». Исследователи выяснили, что в присутствии кислорода происходит гидрокисилирование двух пролинов в регуляторном участке HIF-1. Это и повышает сродство белка к VHL (Stolze et al., 2006). Так как гидроксилирование происходит с участием кислорода, реакция является сенсором его наличия.

Рэтклифф упоминал о факторах, подобных HIF-1 у дрозофил. Также его лаборатория исследовала мутантных C. elegans и обнаружила, что мутация в гене egl-9 приводит к независимому от концентрации кислорода присутствию CeHIF-1. Таким образом, они нашли пролилгидроксилазу EGL-9 у червей, которая регулирует стабильность CeHIF-1 (Epstein et al., 2001). «Вам не нужна лицензия, никакой экспертизы, бедные черви... все они испытывали гипоксию».

«То есть эти ферменты расщепляют молекулу кислорода и добавляют его атом к пролину. Пролин связывается водородными связями с VHL, который способствует деградации HIF в присутствии кислорода. Это — переключатель, он регулирует ответные реакции на гипоксию. О них вы слышали от Грегга, их впервые отметила Фицджеральд в шахтерских городах Дикого Запада в Колорадо. Вот снова она... и ее измерения концентрации гемоглобина в крови, которая зависит от переключения HIF».

Сравнение с растениями и еще один фермент-регулятор

«Казалось, что HIF, пролилгидроксилазы, VHL в такой форме есть только у многоклеточных животных. Но в какой-то момент стало ясно, что все четыре царства эукариот используют подобную систему ферментов для детекции уровня кислорода». Дальше лауреат сравнивает описанные системы грибов, животных, протистов и растений. Интересно, что последние вместо пролилгидроксилаз используют цистеиноксидазы, которые окисляют цистеин белков ERF (ethylene responsive factor). Эти белки являются растительными аналогами HIF, окисление цистеина приводит к их деградации. «ERF отвечают за реакцию растения на затопление. Если вы убиваете свое растение, сильно его поливая, то вы, возможно, убиваете его посредством гипоксии... Растение адаптируется и останавливает деградацию транскрипционных факторов ERF».

Лаборатория Питера решила поэкспериментировать с растительными факторами и ввела ген ERF в клетки человека. Оказалось, что его присутствие в этих клетках также зависит от кислорода, как и наличие HIF. В случае замены цистеина на аланин у ERF белок стабилизировался. Значит, в клетках человека также есть фермент, окисляющий цистеин и участвующий в регуляции ответа на гипоксию (ADO). Если его экспрессировать в мутантном Arabidopsis Thaliana, у которого выключены четыре из пяти цистеиноксидаз, то растение возвращается к исходному фенотипу. Также исследователи показали, что ADO регулирует белки RGS, которые участвуют в сигналинге G-белков (Masson et al., 2019). Интересно, что HIF также взаимодействует с белками RGS.

Как все эти знания можно применить на практике? У пациентов с почечной недостаточностью снижается уровень эритропоэтина, из-за чего возникает анемия. «Билл подробнее расскажет про это: ингибиторы пролингидроксилаз показывают хорошие результаты (повышение гемоглобина) у пациентов с почечной анемией... Но… «You can't always get what you want // But if you try sometime you find // You get what you need» — слова Мика Джаггера и Кита Ричардса. Конечно, не понаслышке они кое-что понимали в разработке препаратов... Но на данный момент эти результаты для ингибиторов выглядят достаточно хорошо».

В конце лекции Питер Рэтклифф поблагодарил прошлых и настоящих коллег, спонсирующие организации, коллабораторов, жену и семью.

Посмотреть на PCR.news лекцию Грегга Семенцы

Посмотреть на PCR.news лекцию Уильяма Кейлина