Воскресное чтение. Обзор научной периодики за 8–14 июля

Технологии редактирования генов

1. Негомологичное соединение концов — тип репарации ДНК, происходящий после внесения разрыва — затрудняет точное определение последствий применения CRISPR/Cas9. Международная группа исследователей разработала метод, связывающий вариант мутации гена с фенотипом клетки, опубликовав результаты в Cell Reports. Для этого они вносили разрыв методом CRISPR/Cas9 в ген анкирина G кортикальных нейронов мыши, мутация в котором приводит к утолщению аксонов. После фенотипического описания отдельных клеток, исследователи собирали их лазерным микродиссектором и секвенировали измененные участки. Им удалось связать морфологию аксона конкретной клетки с характером мутации: например, при изменении обоих аллелей гена начальный сегмент аксона был в три раза шире, чем контрольный. Авторы статьи протестировали систему еще на двух генах: MeCP2 и Satb2.

2. Система CRISPR/Cas9 является одной из самых популярных технологий редактирования генома. Группа ученых из США и Канады получила трехмерные изображения работающего фермента Cas9 при помощи криоэлектронной микроскопии. Они проанализировали положение ДНК, РНК и нуклеазных доменов белка друг относительно друга в трех стадиях: в момент распознавания ДНК, разрезания и связи с продуктом реакции. Результаты исследования, опубликованные в Nature Structural & Molecular Biology, могут лечь в основу модификаций Cas9, повышающих скорость и процессивность его работы (подробнее — на PCR.news).

Генетические модификации растений

3. Геном митохондрий растений в сотни раз больше, чем у животных. В нем содержатся гены, важные для синтеза белков и метаболизма органелл, а также отвечающие за формирование цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС). Согласно статье в Nature Plants, японские ученые нокаутировали гены митохондрий двух растений: посредством белков mitoTALEN они внесли разрыв в кодирующую или соседнюю область генов orf79 риса и orf125 рапса, которые приводят к ЦМС. Разрыв был устранен гомологичной рекомбинацией, что подтверждено секвенированием участков. Полученные растения оказались способны к самооплодотворению – нокаут генов устранил ЦМС.

4. Большинство белков в промышленных масштабах получают посредством культивирования животных или бактериальных клеток. Более продуктивным способом может служить выращивание трансгенных растений в полях. Англо-американская группа исследователей опубликовала в Nature Plants результаты анализа роста двух линий табака в поле, в хлоропласты которых введен ген эндоглюканазы Cel6A. При продукции Cel6A, составляющей в среднем 20% от общей массы белка, трансгенные растения имели сохранившийся фенотип и уровень фотосинтеза практически такой же, как у дикого типа. Ученые предположили, что при выращивании в естественных условиях растения адаптируются к производству чужеродного белка, увеличивая общий синтез белка.

Онкология

5. Для некоторых вариантов иммунотерапии раковых и инфекционных заболеваний используются Т-клетки донора или собственные Т-клетки пациента с измененным Т-клеточным рецептором (TCR). Однако при вставке инженерного рецептора посредством вирусной трансдукции клетка экспрессирует два типа или смешанные рецепторы, что может привести к аутореактивности или реакции «трансплантат против хозяина». Группа исследователей из Германии и США в статье в Nature Biomedical Engineering предложила новый способ редактирования TCR: в гены, кодирующие α- и β-цепи, вносится разрыв посредством CRISPR/Cas9, после чего происходит гомологичная рекомбинация с фрагментом, доставленным невирусно. Таким образом, метод позволяет заменить экспрессию исходного TCR на трансгенный, поместив кодирующую последовательность последнего под контроль естественного промотора. Регуляция экспрессии TCR у таких клеток оказалась сходной с естественными Т-клетками.

6. Секвенатор MinION осуществляет нанопоровое секвенирование длинных ридов. Он имеет несколько преимуществ при анализе вариаций числа копий генов, встречающихся в разных типах рака. Но для эффективной работы ему нужны более длинные участки, чем те, что достаточны для такого анализа. Исследователи из Южно-Калифорнийского университета решили эту проблему. Они предложили SMURF-seq (sampling molecules using re-ligated fragments), в ходе которого короткие фрагменты (примерно 150 п.н.) связываются в длинный (около 8 килобаз) случайным образом, после чего секвенируются. Ученые описали метод в статье в Genome Biology, показав, что его точность не уступает секвенированию на платформе Illumina.

7. Для раковых клеток характерны мутации и изменение метаболизма, позволяющие им неограниченно расти и делиться. Калифорнийским ученым удалось связать мутацию в гене рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), характерную для многих типов рака, с изменением мембраны клетки. В случае этой мутации активируется фермент лизофосфатидилхолинацилтрансфераза (LPCAT1), синтезирующий насыщенный фосфатидилхолин. Фосфолипид встраивается в мембрану и участвует в усилении сигнала от EGFR. После индуцированного выключения LPCAT1 рост опухоли значительно снизился у мышей с введенными в череп клетками глиобластомы — данный фермент может быть потенциальной мишенью противоопухолевой терапии. Результаты исследования опубликованы в Cell Metabolism.

Доставка лекарств

8. Пациентам с сахарным диабетом приходится постоянно контролировать уровень глюкозы в крови и самостоятельно вводить препараты инсулина. В статье в Science Advances предложена система, автоматически выделяющая инсулин в зависимости от концентрации глюкозы. Она представляет собой положительно заряженный полимер, в состав которого входит связывающая глюкозу фенилборная кислота. В растворе молекулы полимера электростатически связывают инсулин. Глюкоза, связываясь с кислотой, снижает положительный заряд комплекса и ослабляет связь с инсулином. Исследователи протестировали систему in vitro и in vivo на мышах и мини-пигах с индуцированным стрептозоцином диабетом: в опытных группах нормальный уровень глюкозы сохранялся в несколько раз дольше.

Эпигенетика, хроматин и хромосомы

9. При одомашнивании вида у него изменяются фенотипические черты и поведение. Есть предположение, что это происходит из-за изменения работы генов, отвечающих за развитие клеток нервного гребня — эмбриональной структуры, дающей начало периферической нервной системе, пигментным клеткам, дентину, хрящам лицевого черепа. Исследователи из Института морских наук в Барселоне проверили эту гипотезу на обыкновенном лавраке, оценив уровень эпигенетических изменений в первом поколении одомашненных рыб. Оказалось, что уровень метилирования генов в разных органах был изменен. Часть этих эпимутаций проявлялась уже на стадии гаструлы и затрагивала гены, экспрессирующиеся в клетках нервного гребня. Статья опубликована в Molecular Biology and Evolution.

10. Длина концевых участков хромосом, теломер, определяет количество возможных делений клетки, и с возрастом они укорачиваются. Тем не менее, испанские ученые показали, что абсолютная длина теломер, вероятно, не связана с продолжительностью жизни организма. Авторы статьи в PNAS определили скорость сокращения теломер в мононкулеарах периферической крови 8 видов животных и птиц, в том числе и человека, количественной высокопроизводительной флуоресцентной гибридизацией in situ. Они обнаружили связь величины этой скорости с массой тела и уровнем метаболизма. Оказалось, что темп укорочения теломер как раз коррелирует с продолжительностью жизни, в отличие от их длины.

11. Трехмерная организация хроматина претерпевает значительные изменения в процессе сперматогенеза. Эти изменения подробно описаны в статье в Cell Reports: ученые из Испании и Австралии при помощи проточной цитометрии выделили клетки разных этапов формирования гамет: сперматогонии, сперматоциты на разных стадиях мейоза, сперматиды и сперматозоиды из мышиных тестикул. В клетках они проанализировали структуру хроматина посредством Hi-C, методом ChiP-seq — его связь с инсулятором CTCF и мейотическими когезинами, участвующими укладке фибрилл, а транскрипционную активность — РНК-секвенированием. В частности, было показано, что характерные для хроматина топологически ассоциированные домены (ТАДы) исчезают при переходе от сперматид к сперматозоидам (подробнее — на PCR.news).

Воспаление: антибиотики и другие препараты

12. Обширное воспаление при повреждении спинного мозга может приводить к необратимой утрате его функций, а используемые противовоспалительные препараты имеют серьезные побочные эффекты. Американские исследователи вводили мышам с травматическим повреждением спинного мозга наночастицы из полилактида-ко-гликолида без какого-либо препарата. Наночастицы, вероятно, связывались с рецепторами иммунных клеток и перепрограммировали их: в месте воспаления было снижено количество моноцитов и нейтрофилов, больше макрофагов экспрессировали маркеры, характерные для регенерации ткани. Также наночастицы способствовали росту аксонов и восстановлению их миелиновой оболочки, сокращению области глиального и фибриллярного рубца и восстановлению подвижности задних конечностей животных.

13. Зачастую новые антибиотики токсичны для организма, а бактерии быстро формируют к ним устойчивость. Французские исследователи получили группу псевдопептидов, имитирующих участок бактериального токсина PepA1, оказывающего антимикробное действие. Два соединения — P16 и P19 — эффективно боролись с метициллинрезистентными штаммами золотистого стафилококка и синегнойной палочки в мышиных моделях сепсиса и кожной инфекции. Эти псевдопептиды связываются с мембраной бактерий, повышая ее проницаемость. В активной и высокой концентрации псевдопептиды были нетоксичны для клеточных культур и мышей. Также, при двухнедельном пересеве бактериальных культур и на мышиных моделях, микроорганизмы не развивали устойчивости к соединениям. (Подробнее — на PCR.news.)

14. Антибиотики назначают большинству пациентов с хронической обструктивной болезнью легких при обострении, хотя две трети таких случаев имеют небактериальную природу. Европейские ученые предложили прописывать антибиотики таким пациентам в зависимости от уровня C-реактивного белка в крови, взятой из пальца. Он является маркером острой фазы воспаления, возникающего в ответ на инфекцию. Исследователи провели испытания, разделив пациентов на получавших лечение в зависимости от анализа и контрольную группу. В первой группе количество пациентов, принимавших антибиотики, было снижено без заметных отрицательных последствий.

Перечень необходимых лекарств

15. ВОЗ обновила перечень основных препаратов, которые должны быть доступны повсеместно. В список, теперь включающий 460 пунктов, добавили 28 препаратов для взрослых, 23 — для детей, а для 26 уже внесенных лекарств — новые способы применения. Например, добавлены 12 препаратов против пяти видов рака, в частности, недавно разработанные пембролизумаб и ниволумаб для иммунотерапии меланомы продвинутой формы (но не для мелкоклеточного рака легких). Также внесены: новые пероральные антикоагулянты — аналоги варфарина, биопрепараты для лечения хронических воспалительных заболеваний и термоустойчивый аналог окситоцина для остановки послеродовых кровотечений. В перечень основных диагностических средств организация добавила новые методы для выявления опухолей, расширила список общих тестов.