NEB и CRISPR/Cas: от выбора мишени до оценки результата

В новом обзоре компания SkyGen рассказывает об истории и преимуществах редактирования геномов с помощью системы CRISPR/Cas, механизмах работы системы и продуктах NEB для полного цикла редактирования — от дизайна эксперимента до проверки эффективности.

CRISPR/Cas — это система адаптивного иммунного ответа прокариот на бактериофаги и плазмиды. Клетка направляет против чужеродных нуклеиновых кислот Cas-нуклеазу, ведомую комплементарной мишени молекулой РНК.

Специалистов по геномному редактированию привлекла возможность нацеливать нуклеазу на конкретную последовательность ДНК или РНК. В лабораторной версии системы используются Cas-нуклеаза и гидовая РНК. Последняя синтезируется с учетом особенностей фермента и мишени. В первых работах использовалась нуклеаза Cas9. Этот белок вносит двухцепочечный разрыв в ДНК-мишень. После этого происходит репарация разрыва за счет негомологичного соединения концов (NHEJ). Это приводит к образованию инделов в месте разрыва и нокауту гена. Если вместе с гидовой РНК и Cas9 в клетку вносится ДНК-заплатка, в сайте-мишени может произойти инсерция по механизму гомологичной рекомбинации, однако вероятность такого события ниже, чем вероятность NHEJ.

CRISPR/Cas дешевле, проще и эффективнее более ранних систем таргетного геномного редактирования — TALEN и ZFN. В настоящее время на рынке доступен широкий спектр Cas-нуклеаз, расщепляющих ДНК и РНК. Кроме того, на основе нуклеазы Cas9 созданы никаза nCas9 и каталитически неактивный фермент dCas9, связывающий ДНК, но не разрезающий ее. В каталоге SkyGen представлены несколько вариантов Cas9, Cas12a, а также инструменты для синтеза гидовых РНК и оценки эффективности редактирования от компании NEB.

Cas-нуклеазу можно доставить в живую клетку в виде мРНК, в составе ДНК-вектора либо в форме белка. В последнем случае в клетку вводится готовый комплекс Cas-белка с гидовой РНК, и этот вариант наиболее эффективный. Для доставки компонентов CRISPR/Cas в живые системы используются электропорация, трансфекция, вирусные векторы и другие методы. Оценить результаты редактирования можно с помощью T7-эндонуклеазы, ПЦР-анализа, секвенирования, рестриктного анализа и белкового электрофореза. Выбор метода зависит от цели редактирования.

Все реагенты и вспомогательные средства, необходимые для подготовки к геномному редактированию с помощью CRISPR/Cas и проверки его результатов производятся NEB и поставляются компанией SkyGen.

При выборе сайта-мишени и гидовой РНК необходимо учитывать частоту встречаемости таргетной последовательности в геноме. Неоптимальный дизайн гидовой РНК увеличивает вероятность нецелевой активности Cas-нуклеазы.

Подробнее о механизмах работы CRISPR/Cas, дизайне эксперимента, методах доставки системы в клетки и проверки результата и научных работах, совершенных с использованием продуктов NEB, — в обзоре #29 Редактирование геномов.

SkyGen также сотрудничает с компанией ToolGen, предоставляющей услуги и готовую продукцию для работы с CRISPR/Cas9.