Сергей Киселев: Если бы не было внегеномного наследования, то ни одна клетка не смогла бы существовать во времени

Сергей Львович, как бы вы определили понятие «эпигенетика»?

В понятие «эпигенетика» входят механизмы взаимодействия неизменного, а именно генома, с постоянно меняющейся окружающей средой, на которую этот геном должен так или иначе отвечать. При всей целостности и неизменности генома каждый индивидуальный организм, так же, как и каждая клетка внутри него, постоянно должны понимать, что происходит снаружи, каким-то образом к этому адаптироваться. Если бы не было внегеномного наследования, то ни одна клетка не смогла бы существовать во времени.

Благодаря эпигенетике клетки, имеющие одну и тот же наследственную программу, дифференцируются в клетки разных тканей?

По поводу «одной и той же программы» — пока мы считаем догмой, что в каждой клетке организма одинаковая генетическая информация. Но я думаю, когда секвенирование нового поколения перейдет на уровень одной клетки, мы увидим, что в процессе развития многоклеточных организмов геном в них оказывается весьма нестабильным.

На самом деле клетки с нестабильным геномом известны — это клетки иммунной системы. При созревании лимфоцитов в них происходят VDJ перестройки — рекомбинации сегментов ДНК, чтобы лимфоциты распознавали ту или иную мишень. За счет этих перестроек и возникает иммунологическая память — специфический В-клеточный либо Т-клеточный ответ на определенный антиген, который мы сохраняем на всю жизнь.

Иммунная система — вещь особая. Но этот принцип, я считаю, будет потом обнаружен — в тех клетках, которые нуждаются в очень долговременной памяти, происходят генетические перестройки. Потому что иных молекул для долгого хранения информации, кроме ДНК, пока еще нет. Белки существуют несколько дней, РНК — вообще несколько минут, ДНК существует долго. Кстати, генетические изменения обнаружены и в клетках мозга, вероятно, они имеют отношение к формированию памяти или касаются регуляции работы генов.

А дифференцировка, дедифференцировка, конечно, осуществляются благодаря эпигенетике.

Три года назад вы рассказывали мне про работы вашей лаборатории по репрограммированию клеток, то есть получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

На самом деле репрограммирование — это всего лишь технология, и на современном уровне уже не является проблемой репрограммировать любую клетку взрослого организма. Главное — зачем, и чем это кончится. У нас были фундаментальные работы, связанные с изучением механизмов технологией репрограммирования, последнюю такую работу мы опубликовали в 2016 году.

Что такое репрограммирование? Это когда мы клетку взрослого организма переводим в юное, эмбриональное, состояние. Зачем это нужно? Чтобы для донора этой соматической клетки сделать что-то хорошее: трансплантировать ему клетки, либо посмотреть вне организма, как могут развиваться какие-то патологические процессы. И здесь важно то, насколько перевод взрослой клетки в юное состояние соответствует тому состоянию, в котором была когда-то давно клетка этого конкретного человека. Когда нобелевский лауреат Шинья Яманака начинал свои работы, появились статьи, что репрограммирование не очень точно переводит клетку в эмбриональное состояние. С того времени, если представить свойства репрограммированных и эмбриональных клеток в виде облаков, эти облака все больше пересекаются. Но, на мой взгляд, даже если эти облака пересекаются на 80%, это примерно то же, что измерять «среднюю температуру по больнице».

Когда мы собираемся сделать для конкретного пациента, как мы сейчас делаем, клетки поджелудочной железы, секретирующие инсулин, — это должны быть именно его клетки, которые прошли тот самый путь, который прошли его клетки в индивидуальном развитии. То есть клетки, которые мы репрограммируем до эмбрионального состояния, должны максимально соответствовать эмбриональному состоянию клеток конкретного человека. Наша работа была направлена на то, чтобы создать критерии, по которым можно оценивать полноту и качество репрограммирования и, самое важное, идентичность репрограммирования.

И вы предложили использовать для репрограммирования клеток РНК.

Да, мы были первыми, кто запатентовал способ репрограммирования клеток человека с помощью РНК. Яманака для введения в клетку четырех генов использовал вирусы. Но мы считали, что для терапевтических целей это не лучший вариант. Есть опасность, что вирус попадет не туда, поэтому лучше минимизировать риски. И мы стали вводить РНК, синтезируемую от тех самых четырех генов Яманаки. В то время как вирус встраивается в геном, РНК делает нужные белки и распадается за 5–6 часов

А потом мы занялись репрограммированием клеток для изучения различных патологий — болезни Паркинсона, болезни Геттингтона, бокового амиотрофического склероза. Мы опубликовали целую серию работ, где получали пациент-специфические репрограммированные клетки и изучали на них молекулярные механизмы патологии. Например, в случае болезни Геттингтона мы даже предложили средство терапии всех полиглутаминовых заболеваний — введение антисенсорного олигонуклеотида к измененному полиглутаминовому тракту, и на модельной системе репрограммированных клеток пациента показали, что это эффективно предотвращает клеточную гибель. Мы также изучали болезнь Штартгардта, приводящую к потере зрения к 25–30 годам из-за формирования липофусциновых гранул в пигментном эпителии сетчатки глаза. Это была история одной семьи. Мы для них получили индивидуальные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и обнаружили мутацию в гене Peripheirin2. Затем с помощью технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9 исправили эту мутацию и получили из исправленных стволовых клеток клетки пигментного эпителия сетчатки, которые потенциально можно трансплантировать для восстановления зрения.

Вы упомянули, что работаете сейчас с клетками поджелудочной железы.

Да, сейчас мы совместно с Эндокринологическим научным центром начали целый ряд работ в области эндокринологии. Например, это работа по геномному редактированию мутаций при моногенном диабете с доказательством возможности трансплантации генетически откорректированых клеток поджелудочной железы пациентам. Это работы с другими интересными заболеваниями, такими как множественная эндокринная неоплазия 1-го типа. Там задействован очень интересный ген men1, и интересно посмотреть, «что первично, курица или яйцо» — этот ли ген служит антионкогеном, либо в процесс неоплазии вовлечены совершенно другие механизмы. Используя репрограммирование, а потом дифференцировку вместе с геномным редактированием, можно это очень элегантно показать. Собственно, то, чем мы занимается последние десять лет, это disease in dish, «болезнь в чашке». Моделирование заболевания для изучения механизмов или для поиска лекарственных средств.

Вы сотрудничаете с Институтом стволовых клеток человека. Вы их просто консультируете или ведете какие-то совместные работы, связанные с клеточными технологиями?

В свое время с ИСКЧ мы начинали несколько работ. Одна из них закончилась коммерческим продуктом — это геннотерапевтический препарат «Неоваскулген». Потом было несколько научных проектов. Сейчас есть пара проектов, которые мы ведем вместе: это создание платформы для получения векторов для генной терапии, направленных на те или иные ткани. Чтобы действие генной терапии стало более тканеспецифичным.

Наверное, сейчас немало болезней объясняется эпигенетическими механизмами?

Есть заболевания, которые напрямую зависят от эпигенетики, например, синдром Ретта, который возникает из-за того, что не происходит инактивация Х-хромосомы, в которой находится мутантный ген. В норме в женских клетках остается в активном состоянии только одна из двух Х-хромосом, другая инактивируется, и это эпигенетический процесс. Интересно, что сначала — на стадии 150–200 клеток — выбор одной из двух Х-хромосом происходит случайно: в одних клетках инактивируется отцовская Х-хромосома, в других — материнская. А что такое инактивация? В хромосоме происходят всякие модификации, и она компактизуется до крошечного тельца Барра. Но при делении клетки хромосома полностью расправляется и становится способной к репликации. А в дочерних клетках именно она снова инактивируется. Выбор сохраняется, наследуется в поколениях клеток. Так вот, синдром Ретта можно устранить при помощи эпигенетических методов. Есть подобные заболевания, связанные с нарушением импринтинга генов: при импринтинге целенаправленно инактивируется один из аллелей — унаследованный либо от отца, либо от матери, и это сохраняется в ряду всех клеточных делений.

А онкология?

На сегодня нельзя сказать, что эпигенетика является первопричиной онкологических заболеваний. Но однозначно, что эпигенетика вовлечена по крайней мере в опухолевую прогрессию, а также во многие другие патологические состояния. Например, спорадические формы болезни Альцгеймера, которые генетически не детерминированы, имеют эпигенетическую компоненту на клеточном уровне.

Можно сказать, что все заболевания, которые генетически не детерминированы, имеют эпигенетическую природу, поскольку это невозможность клетки и, в конечном счете, организма правильно ответить на возникшую проблему. А это значит, что раньше, на каком-то этапе, клетка неправильно прошла специализацию. Почему кто-то заболевает гриппом, а кто-то нет? Те, кто заболел, они как-то эпигенетически более «ущербны», за счет чего их иммунная система оказалась хуже активирована.

Понятно, что эпигенетические изменения передаются в поколениях клеток, а в каких случаях они передаются от одного поколения другому?

Есть достаточно много исследований. Например, пару лет назад у внуков жертв Холокоста были обнаружены одни и те же изменения метилирования, по сравнению с контрольной группой, в генах, каким-то образом относящихся к стрессу. Есть еще нидерландское исследование об ожирении у детей тех, кто голодал во время войны.

Такие вещи могут передаваться, если эпигенетические изменения возникли при формировании половых клеток?

Конечно, передаются они через половые клетки, но как именно, трудно сказать. Потому что работать с половыми клетками человека и с целыми людьми очень сложно. На животных подобные эксперименты, конечно, проводятся, и показано, что эпигенетическое наследование идет независимо и параллельно с генетическим наследованием.

Есть эксперименты, в которых неправильное питание отцов сказывалось на здоровье детей. Эпигенетика через сперматозоиды?

Ну вообще, если говорить про наследование вне ДНК, то оно скорее может происходить по материнской линии, потому что в яйцеклетке можно передать больше внеДНКовых факторов, чем в сперматозоиде.

Почему? ДНК сперматозоида может же нести эпигенетические метки?

Может. Но в эмбрионе они стираются. А в материнской клетке, в цитоплазме, могут функционировать определенные механизмы, которые впоследствии эту метку поставят. То есть наследование по ДНК — это далеко не все. Мы в свое время для упрощения приняли центральную догму молекулярной биологии «один ген — один белок», для упрощения же приняли догму «один ген — один признак» (а это просто Менделю с горохом повезло). Так же мы решили: то, что наследуется при половом размножении, это только ДНК. Но нет. Наследуется куча другой белковой информации. Она оказывает свой эффект на наследственный аппарат, и это передается другим поколениям.

Есть соблазн объяснять эпигенетикой наследование приобретенных признаков…

Смотрите, в свое время японцы жили исключительно на морепродуктах, были худыми и не могли употреблять молоко и мясо. А европейцы, когда вошла в моду восточная кухня, стали есть морепродукты, и у них развилась куча аллергий на них. Прошло 30–40 лет. Японцы стали потреблять мясо и молоко, стали крупнее, у них даже появилась проблема ожирения. А европейцы теперь гораздо меньше страдают от аллергии на морепродукты. Генетические изменения за такой срок не происходят. Это норма реакции организма, это эпигенетический ландшафт, и геном по нему движется. Поскольку от организма идет постоянный запрос, приходится адаптироваться к новым условиям. Будут наследоваться эти эпигенетические изменения? Конечно, будут. Но потом они так же плавно уйдут, если исчезнет мясо или исчезнут морепродукты. Получается, что фенотипические изменения наследуются, но в рамках генетических особенностей организма. Вряд ли человек сможет питаться песком, это будет «плохая замена овса».

Иногда говорят, что от эпигенетического наследования приобретенных признаков один шаг до Лысенко.

Этот вопрос разбирался во многих статьях, и многие писали, что нельзя называть это лысенковщиной. Лысенко описывал некие феномены без их объяснений. Это были феномены растительные, а растения — совершенно отдельная кухня. Как мы знаем, если семена облучать, то происходят полиплоидии — это уже генетические изменения, а влияние холода на стадии развития организма — эпигентика. Растения склонны к этому. Но он не заглядывал так глубоко и это не изучал, во времена Лысенко вся наука была описательной. Сегодня мы пытаемся понять, как молекулы определяют фенотип. Но вопрос в том, на каком уровне некомпетентности мы сами сегодня находимся. Лысенко в той партийно-политической системе был назначен главным, а кто главный, тот и прав. Навешивание клейма «реакционно-идеалистического морганизма-менделизма», это привычный для России ярлык, то есть инструмент устранения, а не причина. Но то, что некоторые фенотипические изменения можно поддерживать на должном уровне в ряду поколений, это правда. Подчеркну, некоторые. За счет чего они поддерживаются? Надо разбираться в каждом случае. Где-то это будет генетика. Где-то эпигенетика.

У Лысенко ведь и фальсификаций было множество…

С фальсификациями наука сталкивается постоянно. Например, Кэтрин Верфайл в 2002 году опубликовала в Nature статью о том, что если стволовые клетки, выделенные из костного мозга, ввести в бластоцисту мыши, то рождается целый организм, то есть клетки из костного мозга имеют свойства эмбриональных стволовых клеток, они плюрипотентны. Она на этом сделала колоссальный бизнес. А в 2008 году, после того, как ни у кого не удалось это воспроизвести, было проведено расследование. И оказалось, что это явная фальсификация. Верфайл объясняла, что не отказывается от тех данных, в ее эксперименте все получилось, но это был «лабораторный артефакт».

Подобных явлений, начиная от прямой подделки данных до нежелания замечать какие-то вещи, множество — это и Паоло Маккиарини, и Пьеро Анверса, у которого была отозвана 31 статья! Если посмотреть внимательно все эти статьи, то в большинстве случаев видно, что они мутные. Но бизнес есть бизнес — они очень рыночные.

Как вы считаете, скандальная история с Маккиарини не подорвала ли большие ожидания, связанные с клеточными технологиями, со стволовыми клетками, которые высказывались несколько лет назад?

Я считаю, что эти ожидания уже давно были подорваны, Маккиарини просто стал печально известен у нас в стране. Но и до него было несколько случаев, связанных с известными учеными. Например, корейский ученый Хван У Сук (Hwang Woo-suk) в 2004–2005 гг. объявил, что произвел терапевтическое клонирование человека, а в 2006 году было доказано, что результаты были сфальсифицированы. Кстати, на протяжении нескольких лет он обещает клонировать мамонта, и якуты с ним хотят сотрудничать. Конечно, это сказалось на направлении.

В том же 2006 году наш соотечественник Шухрат Миталипов подал в Science статью о терапевтическом клонировании приматов. Вышла она только в конце 2007 году, потому что его материалы были переданы в две другие лаборатории для воспроизведения данных. И вышли две статьи — одна Миталипова, а вторая — подтверждающая, что он действительно это сделал.

На мой взгляд, примерно 30% статей в топовых журналах в области стволовых клеток не будут подтверждены. Может быть, и больше. Очень высоки ожидания. Тот же Пьеро Анверса был лидером по кардиальным стволовым клеткам, столько было ожиданий, и все лопнуло. В 2015-м началось разбирательство, в 2016-м его институт вынужден был вернуть грант на 10 млн., который он получил на клинические исследования, и три десятка статей отозваны. Оказалось, это фейк. С Маккиарини — то же самое.

А что из этой области все же дошло до практического применения в медицине?

То, что естественно. Исследование возможностей эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) фантастически продвинулось вперед. Например, в США в последние годы изучение ЭСК человека стало прорывным направлением. Очень удачно проходят клинические исследования для лечения макулодистрофии и кучи других заболеваний — в США, и в Англии, и в Корее, и в Австралии. В США закончена первая фаза клинических исследований для лечения диабета 1-го типа, аутоиммунного, при этом клетки имплантируются в контейнере, чтобы не было иммунной атаки. Но это движение вперед имеет под собой научную базу — из ЭСК в природе действительно получается все, значит, и мы можем попытаться из них получить нужные нам клетки. Но получить клетки дыхательного эпителия из клеток костного мозга или какие-либо специализированные клетки из жира — это смешно звучит. Ни у кого это еще не получилось. Это против природы. Если бы можно было бы из жира получить инсулин-продуцирующие клетки, наверное, организм бы их получил, и произошло замещение.

Не могу не спросить, как Вы относитесь к недавней сенсации, рождению китайских девочек с отредактированным геномом?

Я абсолютно положительно отношусь. Другим просто завидно, что не они первые это сделали.

Но даже если подходить только с научной точки зрения, публикации же нет.

Ну, если они только-только родились, публикация может быть через несколько лет. Потому что они должны быть полностью исследованы.

Технология CRISPR/Cas 9 всего лишь несколько лет используется для геномного редактирования. Есть ли гарантия, что она действует точно, что не повреждаются больше никакие гены, кроме того, который нужно отредактировать?

Несомненно, технологии геномного редактирования, и особенно система CRISPR/Cas9, находятся на ранних этапах разработки. Но еще в 2013 году уже родились генетически редактированные мыши, это работа под руководством Рудольфа Яниша (Rudolf Jaenisch), а потом китайские ученые получили уже целый генно-отредактированный «зоопарк», и мышей, и овец, и козлят, и обезьян. И пока, подчеркиваю, пока, никаких негативов по этим опытам опубликовано не было. Более того, в недавних  публикациях китайские ученые проанализировали геномы этих обезьян и не обнаружили неожиданных мутаций

А вдруг потом окажется, что у китайских девочек возникнут какие-то проблемы со здоровьем, кто будет за это отвечать?

А разве родители отвечают за болезни своих детей? Родители детей, рожденных после ЭКО и/или ПГД (преимплантационная генетическая диагностика), разве не сами делают выбор? Конечно, я говорю о человечестве вообще, о 7,5 миллиардах, а о не маленькой группке моралистов, пытающихся навязать свои условия остальным. Можно вспомнить, как когда-то говорили про Роберта Эдвардса: да как он посмел искусственно зачать ребенка! Я, например, считаю, что этот китаец Хэ Цзянькуй — отважнейший человек.

Вы знаете, что Япония в 2014 году изменила свое законодательство в области внедрения продвинутых медицинских технологий. Они внесли изменения в закон о лекарственных средствах, которые облегчают клинические исследования клеточных продуктов и ускоряют выход препаратов на рынок. Цель изменений была в том, чтобы, с одной стороны, заинтересовать инвесторов, которые платят за клинические исследования, а с другой стороны, чтобы пациенты не страдали по 10–15 лет, ожидая выхода лекарства. Японцы даже подверглись критике американцев за то, что открыли рынок для якобы непроверенных клеточных продуктов. Но при этом японские правила накладывают жесткую ответственность на людей, которые проводят клинические исследования. То есть, ускорение процедуры сочетается с повышением ответственности. Потому что через 20 лет будет 20% пожилого населения, которое надо будет лечить. Нет времени ждать. Более того, 28 сентября 2018 года, еще до анонсирования рождения близнецов, в Японии были выпущены правила, регулирующие геномное редактирование эмбрионов человека, то есть было указано, что это можно делать легально, и как это делать.

Но они же касаются только исследовательских целей, а не репродукции?

Но в этих правилах нет и запрета на то, что нельзя идти дальше. Суть японского подхода в том, чтобы разрешать многое, но с обязательным обсуждением. Например, сейчас они разрешили создавать химерных животных с человеческими стволовыми клетками для выращивания человеческих органов. Но если вдруг более 30% клеток мозга экспериментальной крысы или свиньи займут клетки человека, они прервут эксперимент. То есть, можно делать все, но под адекватным контролем и неся полную ответственность.

Как бы вы оценили уровень российских исследований в области клеточных технологий по сравнению мировым?

У нас их нет. У нас, к сожалению, в 2016 году вышел закон «О биомедицинских клеточных продуктах», который существенно ограничил внедрение этих технологий.

Но закон же формально не касается научных исследований?

Касается. Посмотрите, там с самого начала идет речь о «разработке» биомедицинских клеточных продуктов. А что такое разработка как не исследования? Раз он касается разработки, значит, он касается исследований. Все тут же затормозилось еще на стадии подготовки этого закона и до сих пор стоит на месте. Потому что выполнять то, что напридумывали, просто невозможно, а некоторые положения этого закона могут оказаться просто опасными для пациентов.

В частности, он запрещает работы с эмбриональными стволовыми клетками?

Это даже не самое страшное, хотя пример других стран мог бы быть показателен. Когда в США было введено ограничение финансирования исследований с ЭСК, они отстали от Англии, Японии, Сингапура, Китая, примерно на 20–25 лет, и сейчас вкладываются в это, чтобы наверстать. Именно в работу с ЭСК. А мы теперь от них отказываемся. Ну и в плане остальных клеточных технологий в законе все сделано исключительно безграмотно, и все оказывается просто невозможно довести до конечного продукта. Для этого даются просто нереалистичные условия, и это признается самими разработчиками. Вообще не должно быть такого федерального закона — должны быть нормативные акты.

Что такое клетки? Это тоже лекарственное средство. Да, у него немного по-другому работает входной и выходной процесс, немного другие термины, а по сути это то же самое лекарственное средство. И почему закон по ним должен отличаться? Вот европейцы, например, добавили две или три страницы к существовавшему закону о продвинутых (advanced) лекарственных средствах. Они просто определили по сути, что это такое, ввели термины, как это должно маркироваться и по какому технологическому пути должно тестироваться. Все. Можно подумать, что у нас в России клетки другие. Нет, это тоже «продвинутое лекарственное средство». Но, к сожалению, последние годы делалось все, чтобы не давать этому направлению развиваться. А раз нет перспектив внедрения этого в практику, нет и вложений в научные исследования.

Ну и не могу не спросить, как вы относитесь к недавним заявлениям Дениса Ребрикова о том, что он собирается редактировать геномы эмбрионов, причем не только для защиты от ВИЧ, но и от наследственной глухоты?

Ну как к этому можно относиться? Пока это просто «хайп».