Нарушения в АДФ-рибозилировании теломер препятствуют их репликации

АДФ-рибозилирование, то есть присоединение к биологической макромолекуле остатков АДФ-рибозы, катализируют ферменты из группы АДФ-рибозилтрансфераз, или PARP (поли-АТФ-рибозилполимеразы). Долгое время считалось, что АДФ-рибозилирование является только посттрансляционной модификацией белков, однако в последнее десятилетие выяснилось, что мишенями АДФ-рибозилирования бывают и нуклеиновые кислоты, в том числе ДНК. Могут быть присоединены как отдельные остатки АДФ-рибозы, так и прямые или разветвленные полимеры. Удаляют АДФ-рибозные метки другие ферменты — АДФ-рибозилгидролазы, в особенности PARG. У человека также имеется особая концевая АДФ-рибогликозилгидролаза, или TARG1, которая удаляет последнюю АДФ-рибозу с остатков аспартата и глутамата в составе белков. Интересно, что TARG1 структурно близка к АДФ-рибозилтрансферазе бактерий, удаляющей рибозу с остатков тимина в ДНК.

Роль АДФ-рибозилирования ДНК остается неясной. Авторы нового исследования, опубликованного в Nature Structural & Molecular Biology, показали, что АДФ-рибозилирование теломер препятствует их репликации и стабильности.

Известно, что белок PARP1 участвует в репарации теломерной ДНК, однако он же может способствовать и соединению теломер разных хромосом. Сигналом активации PARP1 служит структура теломеры, а именно выступающий 3’-конец, который вместе с более коротким 5’-концом защищен комплексом, известным как шелтерин. Возможность связывания TARG1 с ДНК в клетках человека и влияние этого фермента на геномную стабильность не были исследованы.

С помощью иммунофлуоресцентного мечения АДФ-рибозы ученые показали, что в клетках, лишенных TARG1, вблизи теломер образуются крупные скопления поли-АДФ-рибозы. Далее авторы работы выделили теломерные ДНК-повторы, сохраняя при этом на них метки поли-АДФ-рибозы, из контрольных клеток линии U2OS, а также из клеток U2O2, лишенных TARG1. В обоих случаях было выделено примерно одинаковое количество двуцепочечной ДНК, но одноцепочечной ДНК выделили существенно больше из лишенных TARG1 клеток. И только в нокаутных по TARG1 клетках на теломерной ДНК обнаружили АДФ-рибозные метки.

Восстановление экспрессии TARG1 в клетках, нокаутных по этому ферменту, приводило к полному удалению АДФ-рибозных меток с теломерной ДНК, однако они сохранялись, если в клетках экспрессировался вариант TARG1, неспособный к гидролизу. Интересно, что PARG удаляет АДФ-рибозные метки лишь частично. Ингибирование PARG приводит к АДФ-риболизированию теломер в контрольных клетках и усиливает связывание АДФ-рибозы с ДНК в клетках с нокаутным или мутантным TARG1.

Авторы объясняют эти наблюдения полученными ранее результатами, свидетельствующими, что PARG полностью удаляет остатки поли-АДФ-рибозы, связанные с белками, но при этом концевые (последние) остатки отщепляют специальные ферменты — моно-АДФ-рибозо-гидролазы. С другой стороны, TARG1 также может удалять концевые остатки АДФ-рибозы. Поэтому ингибирование PARG в клетках, нокаутных по TARG1, вызывает заметный эффект. Это показывает, что PARG1 дополнительно снижает АДФ-рибозилирование теломерной ДНК, удаляя поли-АДФ-рибозу, чтобы предотвратить ее избыточное накопление.

Далее ученые исследовали, при каких физиологических условиях накапливается АДФ-рибоза на теломерной ДНК. Они обработали нокаутные по TARG1 клетки генотоксичным агентом (перекисью водорода) и с помощью специальных ферментов внесли дву- и одноцепочечные разрывы в теломерной ДНК, а также запустили генерацию синглетного кислорода. В ответ запустились сигнальные пути ответа на двуцепочечные разрывы и АДФ-рибозилирование белков. В клетках с нокаутом TARG1 также активно происходило АДФ-рибозилирование теломерной ДНК, причем такие метки накапливаются во время S-фазы. Дополнительные эксперименты показали, что АДФ-рибозилирование теломерной ДНК тесно связано с репликацией ДНК, которая происходит в S-фазе.

В дальнейшем было установлено, что теломерная ДНК подвергается АДФ-рибозилированию преимущественно в отстающей цепи. Более того, главным источником АДФ-рибозильных меток оказалась одноцепочечная ДНК, связанная нелигированными друг с другом фрагментами Оказаки.

Таким образом, АДФ-рибозилирование теломерной ДНК привязано к репликации ДНК. АДФ-рибозилированием теломерной ДНК занимается PARP1, а TARG1 в нужный момент клеточного цикла удаляет эти метки. Фактически их невозможно обнаружить, не инактивируя TARG1, что говорит о жестком контроле данной модификации в здоровой клетке. Более того, удаление TARG1 приводит к нарушению репликации теломерной ДНК: накопление ДНК-АДФ-рибозы представляет угрозу для целостности теломер.

Следовательно, АДФ-рибозилирование ДНК может напрямую влиять на стабильность генома, нарушая репликацию теломерной ДНК. Авторы исследования выражают надежду, что TARG1 и ингибиторы PARP1 могут стать основой для создания новых противораковых препаратов.

Telomouse — мышь с теломерами человеческих размеров