Электропорация CRISPR-Cas9 и одноцепочечной ДНК упростила редактирование клеточных геномов

Достижения в области редактирования генома позволяют с большой точностью встраивать химерные рецепторы антигена (CAR) в локус TRAC (T-cell receptor alpha chain constant region) Т-клеток для запуска противоопухолевого ответа. Некоторые CAR-T клетки уже разрешены к применению в клинике, сотни вышли на этап клинических исследований.

Чтобы заменить или встроить нужную последовательность ДНК в геноме с помощью CRISPR-Cas9, необходимо доставить в клетку не только CRISPR-систему, но и ДНК-матрицу. Вставка при этом осуществляется за счет клеточных механизмов, по пути репарации с участием гомологичной рекомбинации (Homology Directed Repair, HDR). — это предпочтительнее, чем негомологичное соединение разрезанных концов ДНК (NHEJ). Ученые из Института Глэдстона и Калифорнийского университета в Сан-Франциско (США) модифицировали процесс невирусной доставки длинных целевых последовательностей ДНК для эффективного редактирования генома клетки. Технологию можно адаптировать для производства по стандартам GMP.

Для доставки ДНК можно использовать электропорацию или векторы на основе аденоассоциированных вирусов. Применение вирусных векторов позволяет добиться высокой эффективности при низкой токсичности для клеток, но из-за сложности получения векторов стоимость CAR-T терапии существенно возрастает. Электропорация «голой» ДНК быстрее и дешевле, но ее минусы —высокая токсичность для клеток и низкий выход

В предыдущей своей работе авторы описали двухцепочечную ДНК, которая включала в себя матричную последовательность для HDR (ее необходимо вставить в геном), а на обоих концах находились не только участки, гомологичные региону, где должно произойти встраивание, но и сайты узнавания для белка Cas9 с PAM (protospacer adjacent motif). Такую ДНК вместе с наночастицами, содержащими Cas9 и гидовую РНК, доставляли в клетки методом электропорации. Связывание ДНК с Cas9 увеличило эффективность редактирования, но в то же время выросла токсичность для клеток.

Авторы решили адаптировать метод для одноцепочечных последовательностей ДНК, которые считаются менее токсичными. Но поскольку Cas9 связывается только с двухцепочечной последовательностью, они создали такую конструкцию для доставки, в которой матричная последовательность одноцепочечная, а 5’ и 3’ концы создают двухцепочечные сайты узнавания для Cas9,оджигаясь сами на себя и образуя шпильки.

В качестве матричной последовательности выбрали ген альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 (IL2RA, или CD25) сшитый с геном флуоресцентного белка GFP — экспрессия такого химерного белка облегчает отслеживание эффективности нокина. Использовали также укороченный ген рецептора NGFR и ген BCMA. Последовательности встраивались в локусы IL2RA или TRAC, его эффективность оценивали с помощью цитофлуориметрии.

После оптимизации некоторых параметров исследователи нашли оптимальный для доставки дизайн одноцепочечной ДНК. Они снова убедились, что включение в конструкцию сайтов связывания Cas9 увеличивает эффективность нокина. В итоге выход отредактированных клеток вырос в несколько раз по сравнению с двухцепочечными конструкциями.

Добавив коктейль из низкомолекулярных ингибиторов, препятствующих NHEJ, авторы смогли довести количество отредактированных клеток в популяции до 80–90% — это можно назвать блестящим результатом.

Исследователи также показали, что их метод позволяет полностью заменить два гена, связанных с редкими наследственными иммунными заболеваниями, — IL2RA и CTLA4. Это открывает новые перспективы для генной терапии — редактирование по принципу «один размер подходит всем» для пациентов с различными мутациями в этих генах, для которых раньше пытались создавать персонализированные конструкции.

Затем ученые оценили возможность адаптации метода для масштабного производства в GMP-условиях на примере создания CAR-T клеток для лечения множественной миеломы. Они получили среднюю эффективность встраивания, равную 45,8%, на 10-й день культивирования. Количество Т-клеток, несущих целевой CAR рецептор, достигло 1,5 *10⁹ на 10-й день культивирования, что вполне достаточно для проведения клинических испытаний, где доза варьируется в пределах 50–400 *10⁶ CAR+ клеток на пациента.

Авторы работы надеются, что результаты их исследования будут применяться как в фундаментальных исследованиях, так и для диагностики и производства лекарств. Возможно, они упростят разработку новых методов терапии.