Получены дрожжи с наполовину синтетическим геномом

Международный консорциум Sc2.0 (Saccharomyces cerevisiae, версия 2) на протяжении 15 лет работает над созданием синтетического генома пекарских дрожжей. Уже получены синтетические геномы многих вирусов, а также прокариотических организмов (не только знаменитой микоплазмы Крейга Вентера, но и кишечной палочки). Однако для эукариотического организма, то есть имеющего ядро в клетках, такой проект осуществляется впервые. В нем участвуют команды со всего мира — из Великобритании, США, Китая, Сингапура, Франции, Австралии. На прошлой неделе были опубликованы статьи, в которых сообщается об успехах проекта Sc2.0. Синтезированы все 16 хромосом S. cerevisiae, более того, семь с половиной синтетических хромосом удалось объединить в одной функциональной клетке.

Дрожжи были выбраны не только потому, что их геном относительно невелик, но и потому, что в их клетках легко проводить манипуляции с ДНК, есть отработанная технология создания дрожжевых синтетических хромосом. Очевидны многочисленные применения синтетических дрожжей, как в фундаментальной науке, так и в биотехнологии, от пищевой промышленности до получения лекарств и биотоплива.

Исследователи удалили «мусорные» участки генома — мобильные элементы, интроны, повторы, а также добавили новые фрагменты ДНК, позволяющие различать синтезированные и нативные участки генома с помощью ПЦР. Стоп-кодоны TAG заменили на TAA, чтобы высвободить TAG для кодирования нестандартной аминокислоты, если когда-нибудь такая потребность возникнет. Кроме того, они внедрили в геном встроенный «генератор разнообразия», который назвали SCRaMbLE, — между многими генами введены последовательности loxPsym для Cre-опосредованной рекомбинации. Это делает возможной массированную рекомбинацию генов — фактически ускоренную эволюцию, позволяющую быстро получать штаммы с новыми свойствами.

«Мы решили, что важно создать что-то, что было бы сильно изменено по сравнению с замыслом природы, — говорит руководитель Sc2.0 Джеф Буке, специалист по синтетической биологии из NYU Langone Health (Нью-Йорк). — Нашей главной целью было создание дрожжей, которые могли бы научить нас новой биологии».

Кстати, именно команда Джефа Буке недавно предложила метод «переписывания» протяженных участков генома многоклеточных организмов (подробнее на PCR.NEWS).

На первом этапе каждую из 16 синтетических хромосом дрожжей получали независимо и создали 16 штаммов, каждый из которых содержал 15 природных хромосом и одну синтетическую. Так, группа из Великобритании под руководством ученых из Ноттингемского университета и Имперского колледжа Лондона создала синтетическую хромосому XI длиной около 660 т.п.н. и показала, что она не снижает приспособленность дрожжевых клеток. Эта команда также продемонстрировала, что рекомбинационные процессы в синтетическом геноме можно использовать для создания и изучения внехромосомных кольцевых ДНК (вкДНК). У человека вкДНК рассматриваются как факторы старения, причины злокачественного роста и устойчивости к химиотерапевтическим препаратам при многих видах рака.

Новую хромосому, аналога которой нет в природном геноме дрожжей, — тРНК-неохромосому — создали исследователи из Манчестерского института биотехнологии (MIB) при Манчестерском университете. В этой хромосоме размером около 190 т.п.н. размещены все 275 генов тРНК дрожжей, удаленные из других синтетических хромосом. Это сделает более удобными дальнейшие генетические манипуляции с клетками. Кроме того, тДНК известны как «горячие точки» геномной нестабильности из-за столкновений репликационных вилок и частого связывания ретротранспозонов с областями, расположенными выше тДНК. Перемещение генов тРНК на одну хромосому сделает весь геном синтетических дрожжей менее склонным к структурным перестройкам.

Чтобы объединить синтетические хромосомы в одной клетке, Буке с соавторами использовали менделевский метод: скрещивали различные «частично синтетические» штаммы и отбирали линии, несущие две синтетические хромосомы. Таким путем удалось собрать геном, в котором были синтетическими шесть полных хромосом, полученных раньше других (вторая, третья, пятая, шестая, десятая и двенадцатая), и плечо седьмой хромосомы — это более 31% генома. Так как из хромосом были удалены гены тРНК, в каждую из хромосом пришлось временно вставить массив, включающий эти удаленные гены; их можно будет вырезать на заключительном этапе. Штамм имел нормальную морфологию и демонстрировал лишь незначительные дефекты роста по сравнению с дрожжами дикого типа.

Менделевский метод эффективен, однако занимает много времени. Чтобы ускорить процесс, авторы опробовали метод замены хромосомы в два этапа: введение интересующей хромосомы в штамм-реципиент, в результате чего образуется штамм с кариотипом n+1, и дестабилизация нативной хромосомы путем индуцирования транскрипции через центромеру. С помощью этого метода Буке с соавторами заменили хромосому IV и получили дрожжевую клетку с 7,5 синтетическими хромосомами (более 50% генома).

Когда синтетические хромосомы были объединены в одной клетке, ожидаемо проявились «баги», незаметные в клетках, несущих только одну синтетическую хромосому; Буке сравнил наблюдаемый эффект со «смертью от тысячи порезов». Жизнеспособность синтетических дрожжей могут снижать как аддитивное воздействие множества крошечных дефектов в геноме, так и взаимодействие между генами на различных синтетических хромосомах. Исследователи провели «дебаггинг», с помощью метода, основанного на CRISPR-Cas9 (CRISPR Directed Biallelic URA3-assisted Genome Scan, или CRISPR D-BUGS). Метод основан на потере гетерозиготности в диплоидных штаммах, несущих синтетическую и нативную хромосомы; гомологичная рекомбинация между хроматидами усиливается за счет внесения двухцепочечного разрыва с помощью CRISPR-Cas9. Сравнение жизнеспособности серии штаммов, в геномах которых рекомбинация произошла в разных точках, позволяет выявить участок, в котором находится «баг». В итоге авторам удалось повысить приспособленность синтетических дрожжей

Следующим шагом будет интеграция оставшихся синтетических хромосом. В пресс-релизе Ноттингемского университета говорится, что проект может быть завершен уже в 2024 году. «Сейчас мы еще очень далеки от финишной черты — наличия всех 16 хромосом в одной клетке, — заявил Джеф Боке. — Мне нравится называть это концом начала, а не началом конца, потому что только тогда мы действительно сможем начать тасовать эту колоду и производить дрожжи, которые могут делать то, чего мы никогда раньше не видели».

Создана синтетическая клетка, способная к движению