ПЦР-наборы для детекции SARS-CoV-2 из США, Китая и Германии сравнили по эффективности

Когда речь идет о прикладных молекулярных технологиях, сравнение и обобщение данных ничуть не менее важно, чем в фундаментальных исследованиях. Более того, оно часто имеет мгновенный эффект, как технический, так и финансовый. Благодаря беспрецедентной открытости разработчиков диагностических систем на основе ПЦР для детекции SARS-CoV2, детальный сравнительный анализ их эффективности стал возможен практически «в режиме реального времени».

Эффективность работы наборов для детекции SARS-CoV-2 изучали американские исследователи из Йеля и Института Говарда Хьюза. Анализу подвергли диагностические наборы, произведенные центрами по контролю за заболеваниями Китая (China CDC) и США (CDC), университетом Гонконга, а также набор, созданный в Шарите — известном берлинском университетском клиническом центре.

Важно отметить, что последовательности всех олигонуклеотидных праймеров, входящие в состав наборов, предоставлены авторам разработчиками и опубликованы в исследовании. Это означает, что любой заинтересованный исследователь может воспроизвести любой из наборов и самостоятельно проверить его эффективность. Более того, авторы работы синтезировали небольшие «валидационные» фрагменты РНК-генома вируса, не представляющие опасности, объявили о доступности протокола их синтеза и о возможности предоставить эти фрагменты любой исследовательской или диагностической лаборатории. (Использовались гены белков nsp10 и nsp14, РНК-зависимой РНК-полимеразы, а также белков Е и N.)

Авторы подчеркивают, что их главной задачей была валидация наборов праймеров и флуорогенных проб для qPCR (во всех наборах использовалась процедура количественной ПЦР, известная, как метод TaqMan), а не формальная проверка работоспособности каждого теста. Поэтому авторы использовали идентичные условия амплификации для всех тестов (а не рекомендованные производителями наборов). Идентичными были и реагенты для проведения qRT-PCR.

Анализ чувствительности проводили с использованием двух типов образцов: мазков из носоглотки, взятых в 2017 году (в отсутствие SARS-CoV2), в которые добавили заранее известное количество РНК вируса, и реальных клинических образцов, полученных от пациентов, инфицированных SARS-CoV2. При этом для наборов праймеров E-Sarbeco, RdRp-SARSr (Шаритэ), HKU-N, HKU-ORF1 (Гонконг) и 2019-nCoV_N1 (CDC) в мазках 2017 года без добавления РНК SARS-CoV2 было показано отсутствие фоновой неспецифической амплификации. Ни один из этих наборов не детектировал менее 10 копий вирусных геномов на микролитр пробы. Наиболее чувствительными оказались наборы E-Sarbeco (Шарите) and HKU-ORF1 (Гонконг), которые могли детектировать 10 копий/мкл в 75% образцов с добавленной РНК вируса. Все остальные варианты наборов надежно выявляли 100 копий/мкл за исключением RdRp-SARSr из Шарите, порог чувствительности которого был больше 100 копий вирусной РНК.

Ранее было показано, что вариант теста, разработанный CDC США (2019-nCoV_N3), давал ложноположительный сигнал при количествах вирусной РНК менее 10 геномов/мкл. На основании этих данных тест был исключен из рекомендованных для диагностики. То же самое наблюдали и авторы работы. Причина неспецифической амплификации до сих пор неясна; можно предположить, что детектируются геномы сезонных коронавирусов, но экспериментальных подтверждений этому нет. Ряд других тестов (CCDC-N, CCDC-ORF1, 2019-nCoV_N2) также продемонстрировали ложноположительную детекцию при сходном количестве вирусной РНК.

Дальнейший анализ показал, что несмотря на этот недостаток, набор 2019-nCoV_N2 может эффективно использоваться для детекции. При сравнении двух наборов, разработанных CDC США (N1 и N2), с использованием 172 клинических образцов, оказалось, что набор N1 в целом имеет более высокую чувствительность. Неспецифический сигнал для N2 наблюдался в дискретной группе образцов на пределе чувствительности или ниже этого предела. При этом из всех 172 образцов лишь в одном случае был получен неопределенный результат, при котором набор N1 не детектировал сигнал в диапазоне выше своего обычного предела чувствительности, а N2 давал сигнал внутри своего диапазона специфической чувствительности. Авторы получили менее 3% неоднозначных результатов, используя варианты наборов CDC США, что, по их мнению, не так существенно, учитывая высокую чувствительность.

Невысокая чувствительность варианта RdRp-SARSr из Шарите, скорее всего, объясняется тем, что обратный праймер содержал в центральной части вырожденный нуклеотид S (G или С), способный связываться как с С, так и с G. Этот нуклеотид был введен на основании информации о полиморфизме SARS-CoV-1 и коронавирусов летучих мышей, в условиях, когда данные о полиморфизме SARS-CoV-2 практически отсутствовали. Оказалось, однако, что в подавляющем большинстве случаев на соответствующем месте в РНК вируса находится Т. По мнению авторов, замена в праймере вырожденной позиции S на А повысит чувствительность детекции.

Авторы отмечают, что специфичность и чувствительность изученных наборов в целом может считаться высокой, однако предостерегают от прямого переноса полученных данных в клиническую практику без тщательного дополнительного анализа и адаптации методов к имеющимся в руках диагностов оборудованию и реактивам.