Нобелевская неделя 2018. Фрэнсис Арнольд: «Инновация путем эволюции: воплощение новой химии в жизнь»

Фрэнсис Арнольд родилась в 1956 в Питтсбурге, а в 1985 получила степень доктора философии в Калифорнийском университете. Сейчас она занимает должность профессора в калифорнийском технологическом институте. В этом году Фрэнсис была удостоена Нобелевской премии по химии «за направленную эволюцию ферментов»: она была пионером исследований в этой области и впервые смогла получить ферменты, катализирующие реакции, которых не существует в природе.

Фрэнсис начала свою лекцию с рассказа о том, как именно она пришла к идее исследования направленной эволюции. Она, как инженер, была поражена химией биологического мира: всем тем спектром существующих процессов, которые порождают красоту и функциональное разнообразие живой природы, и тем, какие сложные структуры могут возникнуть в результате этих процессов из довольно простых исходных материалов.

Но кто осуществляет эти процессы? Ферменты – удивительные молекулы, катализирующие практически все реакции, протекающие в биологических системах. И процесс их создания, существующий в природе, тоже примечателен: эволюция — мощный механизм генерации природного разнообразия, простой алгоритм, состоящий из мутаций и естественного отбора:

Моей целью было получение новых ферментов, но я, как и многие биоинженеры того времени (1980-х), сталкивалась с ключевой проблемой, которая до сих пор не решена полностью: неясно, как именно в ДНК кодируется функция, выполняемая тем или иным ферментом, и, следовательно, непонятно как именно можно получить фермент с новой необходимой нам функцией. Даже сегодня мы можем считывать информацию с ДНК, синтезировать уже существующие в природе последовательности и даже редактировать их, но до конца не понимаем, как составлять новые. Шифр жизни — как симфония Бетховена: загадочный, прекрасный, но мы не знаем, как создавать что-то подобное.

Оптимизация фермента: отбор из тысяч кандидатов

Фрэнсис сравнила получение новых ферментов с поиском нужной книги в Вавилонской библиотеке Борхеса: среди всех возможных последовательностей большинство не несёт никакого смысла. Если взять относительно большой фермент, то внесение одной мутации в ген, кодирующий его, может дать несколько тысяч вариантов нового белка, двух – несколько миллионов, и с увеличением числа мутаций количество вариантов растёт экспоненциально, а исследовать их все нет никакой возможности.

Джон Мэйнард Смит помог мне решить эту проблему: в своей потрясающей статье, опубликованной в 1970 году, моей любимой статье на полторы страницы, он предложил представить белки в виде организованного пространства, в котором каждая последовательность окружена такими же последовательностями, отличающимися лишь на одну мутацию. И он утверждал, что если эволюция имеет место, …то белки, обладающие функциональными свойствами, должны быть распределены в этом пространстве так, что каждый такой белок окружён хотя бы несколькими белками, также обладающими функциональными свойствами. Таким образом формируется сеть, составляющая возможные направления эволюции.

В эту систему сопоставления последовательностей и функциональных свойств Фрэнсис ввела дополнительный параметр — пригодность — то, за чем следит экспериментатор: обладает ли новый белок требуемыми характеристиками. И согласно гипотезе Мэйнарда Смита, распределение этого параметра в зависимости от числа мутаций должно быть гладким — это значительно упрощало задачу поиска интересующего фермента:

Отличие моих экспериментов от других, о которых вы слышали, заключается в том, что мне не приходится иметь дело с миллионами похожих последовательностей. Мы можем измерять активность фермента от одной последовательности к другой, это составляет десятки тысяч измерений: вносимые мутации часто оказываются пагубными, поэтому для успешной оптимизации нам приходится действовать осторожно, делая маленькие шаги по несколько мутаций, иногда даже по одной, аккуратно регистрируя те незначительные изменения, к которым она приводит. И если вам требуется получить белок, сильно отличающийся по своим свойствам от исходного — а выбор исходного белка очень важен, вы вряд ли сможете получить скаковую лошадь из осла — то вам придётся шаг за шагом накапливать эти мутации, чтобы добиться результата.

Конечно, ферменты, существующие в природе, очень хорошо приспособлены к своим функциям, и если начать их изменять с целью получения новых свойств, их производительность сначала резко снизится. Но впоследствии, из-за наличия постулированных Мэйнардом Смитом промежуточных функционирующих форм, в процессе оптимизации пригодность этих ферментов будет постепенно расти и достигнет нового, достаточно высокого уровня:

Эта гипотеза достигла своей кульминации в статье, опубликованной в 1993 году, в которой Кевин Чень показал, что мы можем приспособить фермент к жёстким неестественным условиям: …путём накопления мутаций можно получить фермент, который выполняет свои функции в 50% или даже 60% растворе диметилформамида так же хорошо, как и в естественных условиях.

От оптимизации существующего к созданию нового: катализ несуществующих реакций

Данный метод оптимизации позволил выявить несколько очень интересных особенностей эволюции ферментов. Конечно, нельзя было предсказать, сколько мутаций придётся внести в фермент, чтобы он смог выполнять новые функции: тем не менее, ферменты приспосабливались очень быстро. Интересно было другое: мутации, приводящие к изменениям, далеко не всегда затрагивали активный центр фермента, напротив, они случались в 20–30 ангстремах от него. Их нельзя было ни предсказать, ни объяснить:

Сейчас я больше заинтересована не столько в оптимизации, хотя она, несомненно, важна, но в том, как именно в ходе эволюции создаются новые ферменты. Как можно создать фермент, катализирующий реакцию, которой даже не существует?

Это очень консервативный процесс, как описано выше, — внесение мутаций поодиночке, но в природе он протекает постоянно, в ответ на воздействия, оказываемые человеком. В качестве такого воздействия Фрэнсис привела в пример антразин — гербицид, до определённого времени не считавшийся биоразлагаемым. Но какой-то из микроорганизмов смог выработать фермент, который позволил ему сделать этот гербицид источником азота, и быстро распространился в живой природе — пример эволюции в режиме реального времени.

Ферменты — это своего рода аспиранты, выполняющие трудную работу за небольшую зарплату, но в свободное время они могут играть на пианино или помыть посуду: они могут при отсутствии нагрузки переключиться с работы на что-то другое. Точно так же и с ферментами: каждый из них имеет побочные, неявные функции, которые эволюция использует в качестве топлива для своих новых изобретений. И если мы выявим эти функции, мы сможем подтолкнуть эволюцию в нужном направлении.

Фрэнсис привела в пример одну из своих работ, проведённую на цитохромах С: в природе существует великое множество их форм, катализирующих различные реакции. Они протекают через несколько стадий интермедиатов, сходных для различных процессов. Группа Фрэнсис выдвинула гипотезу о том, что этот процесс во многом сходен с некоторыми реакциями синтеза, осуществляемыми организмом человека, и если немного модифицировать активный центр фермента, можно получить новый класс ферментов — карбентрансфераз, способных катализировать превращение соединений, содержащих двойные связи, в циклопропаны. И этот класс был получен: карбентрансферазы смогли катализировать даже те реакции, протекание которых было значительно затруднено в лабораторных условиях, а в природе их вовсе не существовало.

Один из коллег Фрэнсис, Кай Чень, пошёл дальше и модифицировал фермент таким образом, чтобы он мог переносить на циклопропан второй карбен, в результате чего синтезировался бициклобутан. Этот механизм синтеза оказался стереоспецифичным, разные ферменты создавали разные условия протекания реакций: так было получено несколько стереоизомеров бициклобутана:

Бициклобутаны — интересные молекулы, которые плохо получалось синтезировать в лабораторных условиях, но мы смогли получить фермент, научившийся делать это всего через несколько поколений мутаций, и он может существовать в живых клетках. Таким образом, синтез упрощается до введения фермента в культуру бактерий и последующего снабжения их необходимыми субстратами.

Создание несуществующих связей

Кремний — один из самых распространённых в природе элементов, при этом ни разу в живой природе не было обнаружено химической связи между ним и углеродом. Такой процесс недавно был обнаружен у галофильных организмов из исландских водоёмов: у них был найден фермент, катализирующий перенос метильной группы на диметилфенолсилан:

Безусловно, эти реагенты не распространены в живой природе, но, тем не менее, существует белок дикого типа, катализирующий синтез кремнийорганических соединений, — отметила Фрэнсис. — Более того, это цитохром С, настолько устойчивый, что его можно кипятить.

Этот фермент обладает ещё одной интересной особенностью: его активный центр полностью спрятан внутри белка, гемопорфириновое кольцо, входящее в его состав, экранировано различными лигандами. Если попытаться рассчитать объём активного центра методами молекулярного моделирования, он будет равен нулю:

Природу не заботят наши расчёты, и мы видим, что этот фермент прекрасно справляется со своей функцией …а также эволюционирует, и три поколения мутаций могут увеличить эффективность этого неявного свойства фермента в десятки раз. Просто поверните рычаг, дайте им немного сахара, и ферменты будут эволюционировать.

Три мутации, о которых упомянула Фрэнсис, привели к существенным перестройкам активного центра фермента: возле железа в активном центре, где раньше всё было плотно упаковано, возникла петля, образующая карман, в котором могут размещаться различные субстраты. И это приводит к значительному увеличению эффективности.

Но можно ли образовать связи с другими атомами? Группа Фрэнсис недавно опубликовала ещё одну работу, посвящённую ферментативному катализу образования связей между углеродом и бором — связей, которые также не были обнаружены в природе. Он был получен по тому же принципу, что и предыдущие: правильный выбор исходного фермента, несколько поколений мутаций для оптимизации — и рост эффективности в 400 раз на выходе.

Углерод в природе может образовывать связи с небольшим числом элементов: с водородом, кислородом, азотом, серой, некоторыми галогенами и ещё несколькими. Но остаётся ещё значительная часть таблицы Менделеева, и всего за два года мы смогли расширить этот список на два дополнительных элемента. Теперь мы можем получать кремнийорганические и бороганические соединения и каким-то образом модифицировать их в различных метаболических путях.

Мы получили новый мощный инструмент, работающий не только на молекулярном уровне, но и на уровне целых экосистем, и он позволяет не только оптимизировать их, но и придавать новые свойства в режиме реального времени. Если говорить о химии, то теперь мы можем стереть границу между химическими превращениями, осуществляемыми человеком, и теми, что протекают в живых системах. …Это своего рода золотая жила возможностей: теперь мы можем генетически закодировать и упростить множество различных химических реакций.

Мир живой природы невероятно разнообразен: существует невероятное число белков, пригодное для решения ваших задач, и если мы научимся применять их с пользой для себя, мы сможем устремиться к более экологичному будущему и создавать топливо и лекарства с применением биологических систем.

Перед нами целая неисследованная Вселенная и космический корабль, чтобы изучить её, и имя ему — эволюция.