Биологи ускорили созревание астроцитов в органоиде

Астроциты — наиболее представленный тип глиальных клеток в мозге. Однако в естественных условиях они долго созревают, поэтому в органоидах мозга астроциты практически не представлены. Так, в органоидах коры головного мозга астроглиогенез начинается только на третий месяц культивации и длится около года. Американские ученые представили новый органоид кортекса с астроглией, в котором этот процесс ускорен.

Исследователи выращивали органоиды кортекса из человеческих эмбриональных стволовых клеток. Чтобы ускорить астроглиогенез, ученые добавляли в органоид PDGF-AA — глиогенный фактор — и выращивали его в среде для астроцитов, содержащей все необходимые факторы роста для них.

Уже через три недели культивации часть клеток-предшественников дифференцировалась в астроциты, о чем авторы работы судили по повышению экспрессии глиогенного фактора NFIA. Через 8 недель в органоиде активно происходили и нейрогенез, и астроглиогенез. Так, ученые детектировали маркеры астроглии — GFAP и HepaCAM. На 10-й неделе они провели секвенирование РНК единичных ядер (snRNA-seq) органоидов, чтобы охарактеризовать клеточное разнообразие. Около трети всех клеток органоида составляла астроглия.

На третьем месяце культивации органоида авторы также исследовали морфологию астроцитов в нем. Для этого они трансдуцировали клетки органоида аденоассоциированными вирусами, несущими GFAP с зеленым флуоресцентным белком (GFP) — таким способом пометили отростки астроцитов. Со временем у астроцитов повышалось число отростков, увеличивалась их разветвленность.

Чтобы лучше воспроизвести естественную среду, в которой обычно находится мозг, ученые трансплантировали органоиды кортекса, находящиеся на 8–10-й неделе культивации, в ретросплениальную кору иммунодефицитных мышей. Органоиды успешно интрегрировались в мышиный мозг: в них сохранялись как мышиные, так и человеческие нейроны и астроциты. При этом человеческие астроциты оказались крупнее мышиных и имели более разветвленные отростки. Кроме того, исследователи обнаружили различные типы человеческих астроцитов, которые отличались друг от друга как по морфологии и расположению в коре головного мозга, так и по функциям. Так, в пиальной части (в области мягкой мозговой оболочки) трансплантата находились интраламинарные астроциты, а в самом кортексе — протоплазматические (с большим количеством толстых коротких отростков). Если в пиальных астроцитах была повышена экспрессия аквапоринов, то в кортикальных преимущественно экспрессировались гены, регулирующие биосинтез холестерина и образование синапсов. В трансплантате также присутствовали фиброзные астроциты, в которых экспрессировались гены, отвечающие за начало миелинизации. Впервые в органоиде исследователям удалось обнаружить узловые астроциты, характерные только для гоминид.

Астроциты в мозге активно взаимодействуют и с нейронами, и с сосудами. С помощью электронной микроскопии ученые показали, что в трансплантате астроциты находились вблизи синапсов нейронов. Также подтвердилось взаимодействие с сосудами: отростки астроцитов покрывали всю поверхность сосудов в трансплантате.

Исследователи подтвердили, что им удалось ускорить созревание астроцитов в органоиде мозга. Для этого они провели snRNA-seq на органоидах, которые выращивались 5 месяцев in vitro, и на трансплантатах возрастом 5, 6 и 8 месяцев. Дальше по транскриптому ученые предсказали «возраст» клеток, т. е. стадию их развития. Трансплантированные органоиды оказались в среднем «старше» выращенного in vitro, и больше 75% всех ядер клеток в них соответствовало постнатальной стадии развития, происходящей приблизительно на 300 сутки. Ученым впервые удалось вырастить настолько зрелые астроциты: в предыдущих подобных органоидах чуть больше половины ядер клеток соответствовали такой стадии развития.

Далее авторы работы изучили на органоиде функции астроцитов во время нейровоспаления. Ранее предполагалось, что астроциты реагируют на повреждение тканей мозга универсальным образом, однако новые данные указывают на гетерогенность астроглии и, соответственно, ее ответов. Чтобы проверить это, ученые стереотаксически вводили в трансплантаты TNFα  — провоспалительный цитокин, который может вызывать реактивный глиоз. Через пять часов после инъекции они отбирали астроциты для секвенирования РНК единичных клеток (scRNA-seq). В результате исследователи обнаружили популяцию реактивных астроцитов, в которых была повышена экспрессия GFAP, CD44 и CD38. В них также были активны гены, ассоциированные с воспалением и нейротоксичностью, в том числе связанные с активацией путей интерферона и NF-κB. В то же время в реактивных астроцитах была снижена экспрессия генов, связанных с окислительным фосфорилированием, необходимых для сборки митохондриальных дыхательных цепей или комплекса NADH-дегидрогеназы.

Чтобы подробнее изучить изменения, происходящие в астроцитах на клеточном уровне, исследователи обрабатывали культивируемые in vitro органоиды TNFα в течение 24 часов. Они также обнаружили воспалительный ответ: активировались пути интерферона и NF-κB, вырабатывались провоспалительные цитокины. В реактивных астроцитах ученые обнаружили признаки окислительного и метаболического стресса, о чем свидетельствовало сниженное соотношение NAD⁺/NADH и восстановленной и окисленной форм глутатиона. Известно, что на уровень NAD⁺ влияет CD38, осуществляющий его гидролиз: чем активнее экспрессируется CD38, тем ниже уровень NAD⁺. И действительно, в реактивных астроцитах был представлен CD38. Чтобы проверить, вызывает ли CD38 окислительный и метаболический стресс, ученые обрабатывали астроциты не только TNFα, но и ингибитором CD38. В этом случае снижался и уровень клеточного стресса, и фрагментация митохондрий, которую он вызывал. Эти данные позволили ученым сделать вывод о том, что CD38 способствует нарушению регуляции метаболической и митохондриальной активности в реактивных астроцитах при воспалении.

Таким образом, исследователи представили органоид коры головного мозга, в котором присутствовала астроглия. Им удалось сократить время созревания астроцитов. Такой органоид позволит изучать физиологические и патологические процессы, протекающие в мозге, в более приближенных к реальности условиях по сравнению с животными моделями.



Эпигенетический «тормоз» развития нейронов можно отключить