Эпигенетический «тормоз» развития нейронов можно отключить

По данным ВОЗ, в мире ежегодно диагностируется до 10 миллионов новых случаев деменции. Поэтому изучение нейродегенеративных заболеваний в лабораторных условиях очень важно, но его осложняет, в частности, крайне медленное созревание человеческих нейронов в культуре клеток. Ученые из Мемориального онкологического центра Слоуна — Кеттеринга (MSK) и Медицинского колледжа Вейлов Корнеллского университета получили новые данные о регуляции развития нейронов и смогли ускорить этот процесс.

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) в нейроны включает образование нейрональных клеток-предшественников (НКП), их миграцию и специализацию, встраивание в уже сформированные нейронные сети и, наконец, полное созревание. Известно, что дифференцировка регулируется специфическими транскрипционными и эпигенетическими путями, а порядок, продолжительность и скорость ее этапов у различных видов in vivo во многом сохраняются ex vivo. Так, человеческие ПСК в культуре созревают существенно дольше, чем клетки грызунов или даже приматов, что соответствует медленному развитию сложного человеческого мозга. Даже если их трансплантировать мыши, темпы остаются медленными. Например, нейроны коры, полученные из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), в коре мозга мыши созревают девять месяцев, а не четыре, как нейроны из иПСК мышей.

Еще одна проблема моделей на основе ПСК — несинхронное созревание. Исследователи разработали метод культивирования in vitro, при котором ПСК развиваются в нейроны коры синхронно, как однородная популяция. Это позволило им составить атлас морфологического, функционального и молекулярного созревания нейронов, обнаружить эпигенетический барьер, регулирующий скорость созревания, и научиться управлять ей.

«Предыдущие исследования предполагали наличие внутри клеток “часов”», которые задают темп развития наших нейронов, но их биологическая природа в значительной степени оставалась неизвестной — до сих пор», — говорит руководитель исследования Лоренц Штудер.

Исследователи получили из человеческих иПСК нейрональные клетки-предшественники с помощью двойного ингибирования SMAD и ингибирования сигнального пути WNT. На 10-й день дифференцировки были экспрессированы специфические клеточные маркеры, а на 20-й образовалась получена однородная популяция клеток-предшественников нейронов коры. После этого за счет оптимизации плотности клеток и ингибирования с помощью DAPT сигнального пути Notch, который играет важную роль в эмбриональном развитии и участвует в пролиферации во время нейрогенеза, удалось запустить синхронный нейрогенез. Авторы наблюдали нейроны до ста дней после индукции. Чтобы идентифицировать механизмы, связанные с темпами созревания, исследовали как морфологию, так и экспрессию генов.

В ходе развития клеток существенно снижалась экспрессия генов, вовлеченных в организацию хроматина и эпигенетическую регуляцию. Авторы предположили, что именно эпигенетические факторы ответственны за медленное созревание человеческих нейронов. С помощью CRISPR-Cas9 они нокаутировали 18 регуляторов хроматина и три фактора транскрипции, активность которых снижалась в ходе развития нейронов. И действительно, им удалось обнаружить несколько регуляторов хроматина, отключение которых ускоряло развитие. Таким образом, существует своего рода эпигенетический «тормоз», который быстрее отключается у мыши и медленнее — у человека. Авторы отмечают, что могут существовать и другие пути регуляции темпов нейрогенеза.

Примечательно, что большинство эпигенетических факторов, регулирующих созревание нейронов, экспрессируются уже в делящихся нейрональных клетках предшественников, на самых ранних стадиях процесса.

Авторы идентифицировали EZH2, EHMT1/2 и DOT1L, вовлеченные в метилирование гистонов, как ключевые компоненты эпигенетического барьера. Наибольший эффект давал первый из них. Временное ингибирование EZH2 в НКП существенно ускоряло темпы развития нейронов человека: к 35-му дню они достигали тех же показателей экспрессии, что контрольные нейроны к 50-му.

В мышиных клетках-предшественниках менее активно экспрессировался ген Ezh2, чем в человеческих, а его временное ингибирование давало более скромный эффект. Зато ингибирование деметилаз — антагонистов EZH2 замедляло развитие нейронов.

Наконец, авторы исследовали расположение метилированных гистонов с помощью CUT&RUN и установили, на какие гены действует ингибирование EZH2. Полученные результаты говорят о том, что эпигенетический барьер является двойным. Он контролирует время созревания нейронов как напрямую, поддерживая гены созревания в сбалансированном состоянии, так и косвенно, модулируя экспрессию конкурирующих эпигенетических регуляторов, способствующих созреванию.

Второе исследование, проведенное аспирантами из лаборатории Штудера, представляет комбинацию четырех химических веществ, которые вместе могут способствовать созреванию нейронов. Химический коктейль, который авторы назвали GENtoniK, одновременно подавляет эпигенетические факторы, тормозящие созревание клеток, и стимулирует факторы, способствующие ему.

Получены норадреналиновые нейроны из стволовых клеток человека