Малая молекула подавляет репликацию кожного папилломавируса, не вредя клеткам хозяина

Вирусы папилломы человека (ВПЧ) вызывают поражения слизистых оболочек или кожи. Кожные ВПЧ, в отличие от «слизистых», не встраивают свой геном в хромосомы, а реплицируют его в ядре в виде множества плазмид. Для этого нужно всего два белка — хеликаза E1 и фактор транскрипции E2. В целом кожные ВПЧ менее опасны, чем «слизистые», так как они меньше затрагивают геном хозяина и не настолько сильно повышают риск онкологических заболеваний. В большинстве случаев инфекция протекает легко — с образованием пятен или бородавок либо бессимптомно. С другой стороны, против наиболее опасных «слизистых» штаммов ВПЧ, вызывающих рак шейки матки, уже существуют эффективные вакцины, в то время как против кожных ВПЧ к настоящему моменту нет ни вакцин, ни лекарств. ВПЧ-5, 8 и 38 классифицируются как проонкогенные, то есть в сочетании с другими факторами (воздействие ультрафиолета или канцерогенных веществ, иммуносупрессия) они могут вызвать немеланомный рак кожи.

Команда эстонских исследователей обнаружила соединение, ингибирующее репликацию ВПЧ-5 — по крайней мере, в клеточных культурах. Для этого ученые провели высокопрозводительный скрининг библиотеки низкомолекулярных соединений Национального института онкологии США. Клетки линии U2OS (остеосаркома человека) заражали модифицированным ВПЧ-5, несущим ген нанолюциферазы. Противовирусный эффект соединений — всего проверили 1584 молекулы — оценивали по активности нанолюциферазы после добавления его к клеткам и двух суток инкубации. Из них 81 молекулу авторы сочли эффективной и протестировали дозозависимость эффекта. После этого осталось 22 вещества, воздействие которых на репликацию вирусного генома оценили с помощью саузерн-блоттинга на второй, третий и четвtртый день инкубации. Такой скрининг позволил отобрать два вещества-кандидата —5-нитро-1,10-фенантролин (NSC4263) и 5,7-диметокси-2-пиридин-3-илхромен-4-он (NSC51349). Их проверили на селективность — NSC4263 подавлял репликацию как кожных ВПЧ-5 и ВПЧ-8, так и «слизистых» ВПЧ-11 и ВПЧ-18, в то время как NSC51349 был эффективен только против кожных ВПЧ. Казалось бы, NSC4263 был более перспективен благодаря широкому спектру действия — но на следующем этапе, при проверке на цитотоксичность, он показал дозозависимое снижение количества жизнеспособных клеток U2OS на второй и третий день по сравнению с контролем. Дальнейшая проверка показала, что NSC4263 не проявляет прямую цитотоксичность, а блокирует клеточный цикл, тем самым подавляя пролиферацию клеток. Видимо, и репликацию ВПЧ он подавляет опосредованно, подавляя пролиферацию клеток-хозяев, а не воздействуя на вирус напрямую.

Для NSC51349 количество жизнеспособных клеток культуры на второй и третий день не отличалось от контроля, то есть эта молекула не проявляет цитотоксчности и не блокирует клеточный цикл. В эксперименте на первичных человеческих кератиноцитах — основной мишени вируса — вещество NSC4263 не настолько существенно подавляло пролиферацию клеток, а при малой дозировке эффект был незаметен; однако было обнаружено, что NSC4263 влияет на дифференцировку кератиноцитов, вдвое повышая экспрессию маркера ее ранней стадии инволюкрина (INV) и вчетверо — маркера поздней стадии лорикрина (LOR). Обнаружив этот нежелательный эффект, ученые прекратили дальнейшие исследования NSC4263. В то же время NSC51349 подавлял репликацию ВПЧ-5 в человеческих кератиноцитах, не оказывая влияния на их дифференцировку.

С помощью РНК-интерференции авторы статьи установили, что NSC51349 подавляет именно репликацию генома вируса, обусловленную вирусными белками E1 и E2, а не клеточные механизмы. Затем в экспериментах с нокаутом генов ученые подтвердили, что мишень NSC51349 — именно белок E2 (а не E1 и не клеточные факторы транскрипции, также участвующие в процессе). Предположительно, сайт взаимодействия малой молекулы с этим белком находится на стыке трансактивирующего и петлевого доменов, а также в ДНК-связывающем домене — на это указали результаты молекулярного докинга.

Полученные результаты позволяют предположить, что NSC51349 может лечь в основу разработки противовирусных препаратов против разновидностей ВПЧ, поражающих клетки кожи.