Нобелевская неделя 2018. Джордж П. Смит: «Фаговый дисплей: простая эволюция в чашке Петри»

Процесс эволюции в природе происходит от фенотипа к генотипу: пока изменения генотипа существенным образом на фенотип не влияют, никакие изменения под действием среды невозможны. Эти процессы могут идти естественным путём, а могут — как у мичуринцев и производителей аминокислот, антибиотиков и других метаболитов микроорганизмов — искусственным. В огороде привычном или молекулярном — в пробирке.

Смиту удалась своего рода деконволюция — никто до его работы не мог свести эволюцию к пробирке и к одному-единственному белку за раз. One at a time, как наверняка сказал бы сам исследователь. Помещая в геном бактериофага ген, который кодирует интересующий его белок или пептид, Смит добился того, что признак, кодируемый этим геном, — тот самый белок, — оказался экспонирован в окружающую среду и при этом остался связан с той самой фаговой частицей, в которой он закодирован. Отбирая этот белок, например, по его способности связать другой белок или небелковую молекулу, или даже по способности катализировать какую-то реакцию, мы вместе с белком отбираем и геном бактериофага, его кодирующий. Отбирается не просто геном, но и способность размножить его и нужный признак снова и снова. То есть происходит передача по наследству. Но не спонтанно, а направленно, руками экспериментатора.

Хотите создать фермент, распознающий видоизменённый субстрат? Пожалуйста. Пептид, блокирующий важный метаболический путь или мимикрирующий сложный антиген? Нет проблем. Антитело,  излечивающее… но это уже история про другого лауреата.

В начале лекции лауреат задался вопросом о том, что же такое на самом деле химия:

Мой друг, который и правда настоящий химик, узнав про Нобелевскую премию, очень удивился, что я, как оказалось, тоже принадлежу к этой специальности.

Эта шутка, в которой лишь доля шутки, подчёркивает тот факт, что настоящее открытие находится вне граней научных дисциплин и принадлежит науке и человечеству в целом.

Джордж Смит, как и многие неординарные люди, обладая своеобразным чувством юмора, отдал должное своим присутствующим в аудитории супруге и родственникам, а также не присутствующим коллегам, особенно тем, кто принял непосредственное участие в работах по созданию технологии фагового дисплея. Все они «чертовски хорошие люди», заключил учёный:

Извне может показаться, что создание фагового дисплея было эдаким озарением, одномоментным открытием, но на самом деле — нет, изнутри это была работа, которая состояла из целого ряда небольших изобретений, постепенно приближавших меня к цели.

Лауреат посвятил свою лекцию рассказу о тех шагах, которые привели к созданию этой удивительной технологии искусственной эволюции пептидов и белков.

Бактериофаги, или, попросту, фаги — вирусы, которые инфицируют бактерии. Фаг, послуживший первичной основой для дисплея, называется нитевидным. Это достаточно просто устроенный вирус, его ДНК кодирует всего несколько белков, часть из которых составляет фаговую оболочку, контактирующую с внешней средой. Инфекция бактерии нитевидным фагом не убивает её, но в течение ночи из литра среды, в которой выращивалась инфицированная вирусом культура кишечной палочки, единственная фаговая частица даёт потомство в тысячу триллионов вирусных частиц! Используя бактериофаги, с очень небольшими усилиями и финансовыми вложениями можно создать гигантскую платформу для формирования биоразнообразия.

Фаговый дисплей родился в конце моего творческого отпуска, который я провел в лаборатории Боба Вебстера, в университете Дьюка. Боб был признанным авторитетом в области бактериофагов, а я — новичком.

Смит сконцентрировался на работе с одним из белков фаговой оболочки, так называемом pIII, который важен как для завершения упаковки фаговой ДНК и поддержания структурной целостности частицы, так и для обеспечения фаговой инфекции. Внешняя часть pIII конформационно весьма пластична и связывается с бактериальными пилями, обеспечивая контакт вируса и бактерии:

Структурная пластичность белка pIII, о которой было известно из многих источников, подсказала мне, что можно попытаться вставить в кодирующий его ген фрагмент чужеродной ДНК. В результате на поверхности фаговой частицы в составе удлинённого pIII будет экспонирован чужеродный пептид, закодированный в геноме бактериофага, а функционирование самого pIII не нарушится.

Для того чтобы сделать следующий шаг, Смит обратился к Полу Модричу (ставшему Нобелевским лауреатом по химии в 2015 году). Модрич предоставил ген рестриктазы EcoR1 и антитело, распознающее саму рестриктазу. Смит поместил фрагмент гена EcoR1 в ген белка оболочки бактериофага и вырастил химерные фаговые частицы, которые должны были экспонировать на своей оболочке кусочек рестриктазы. Когда Смит получил эти частицы и смешал их с антителам к EcoR1, фаги потеряли способность инфицировать кишечную палочку! Это означало полное подтверждение предположения, высказанного исследователем.

Базируясь на этом открытии, Смит приступил к разработке системы для аффинной селекции с использованием фагового дисплея. Необходимо было создать на основе фаговой ДНК удобный вектор для клонирования библиотек пептидов, а затем придумать модель, которая могла бы продемонстрировать возможности этой технологии. Работа была сложной и заняла несколько лет. Достаточно сказать, что Роберт Дэвис, отвечавший у Смита за технические аспекты исследований, в ходе работы вручную, методом Сэнгера, используя радиоактивную метку, просеквенировал около миллиона нуклеотидов.

Кульминацией исследования было создание модели на основе двух фрагментов рибонуклеазы, получающихся при её ограниченном протеолизе субтилизином. По отдельности, большой и малый фрагменты РНКазы — С-белок и С-пептид (последний длиной всего 20 аминокислотных остатков) — не активны, но при смешивании восстанавливают исходную активность РНКазы:

Мы в шутку назвали эту модельную систему «болезнь С-белка» Представьте себе, что у вас есть рецептор, который, например, связывает лиганд — пептидный гормон, роль которого в этой модели играет С-пептид. И если гормона по каким-то причинам продуцируется слишком много, то развивается заболевание.

Исследователи решили выяснить, возможно ли, используя метод фагового дисплея, из библиотеки пептидов произвольной и заранее неизвестной структуры, получить пептидный лиганд, который бы, как C-пептид восстанавливал рибонуклеазную активность. Для этого они синтезировали библиотеку нуклеотидных фрагментов с произвольной структурой и клонировали в ранее разработанный вектор для дисплея. Таким образом, после трансформации в кишечную палочку и последующего размножения фагов, сформировалась библиотека из 1015 фаговых частиц, содержащая 250 млн. уникальных пептидных последовательностей.

Невозможно по одному тестировать все 250 млн. пептидов на связывание и активацию С-белка, но это и не нужно, потому что была разработана процедура аффинной селекции фаговой библиотеки. Для того чтобы отобрать искомый пептид, С-белок иммобилизовали на поверхности чашки Петри простой адсорбцией, и затем смешали с суспензией, содержавшей фаговую библиотеку. Фаги, оставшиеся в растворе, удалили отмывкой, а связавшиеся с С-белком элюировали с применением специальных методик. Фаги, содержащие пептид, аффинный к С-белку, несут в геноме ДНК, в которой закодирована информация об этом пептиде. Очевидно, что таких фагов будет немного даже в огромной библиотеке. Да и селективность единственной стадии отбора далека от идеальной. Но поскольку отобранные фаги можно размножить, инфицируя E. coli, то и процедуру аффинной селекции можно повторить, но уже с популяцией фагов, значительно обогащённых пептидами, аффинными к C-белку. В результате проведённой селекции, одна из пептидных последовательностей была представлена среди полученных фаговых клонов с намного большей частотой, чем другие:

Очень важно отметить, что ни в процессе синтеза библиотеки, ни в ходе селекции, мы не использовали никакую информацию о природном С-пептиде. И поэтому было очень интересно сравнить отобранный пептид с природным С-пептидом.

Пять аминокислот оказались идентичными в С-пептиде и в отобранном из библиотеки пептиде, причём четыре из них составляли гидрофобный кор — тот самый участок С-пептида, который образует интерфейс для связывания с С-белком. Это наблюдение продемонстрировало успешность метода фагового дисплея.

Эта искусственная селекция в чашке Петри, в некоторых своих важных аспектах, очень похожа на естественную эволюцию. Естественная эволюция критически зависит от разнообразия, создающего многообразные варианты живых существ. В фаговом дисплее это реализуется за счёт создания гигантских библиотек, содержащих огромное разнообразие экспонированных пептидов. Далее, эволюция зависит от естественного отбора, который благоприятствует отбору каких-то вариантов и не благоприятствует отбору других. И точно так же, в фаговом дисплее аффинная селекция является сильнейшим фактором отбора определённых вариантов пептидов.

…Таким образом, используя фаговый дисплей, мы нашли лекарство от воображаемой болезни С-белка, скажем так, чудо под номером 1. Но из той же самой библиотеки, используя другой метод селекции и другой рецептор, мы можем получить чудеса под номерами 2, 3, и так далее.

Используя подход, разработанный Смитом, улучшая и модифицируя его, другие исследователи получили поистине чудесные молекулы с новыми уникальными свойствами.