Нобелевская неделя 2018. Грегори Пол Винтер: «Использовать эволюцию, чтобы делать лекарства»

Традиционно в начале лекции сэр Грегори Винтер выразил благодарности семье, сотрудникам, а также тем, без кого не может работать ни один исследователь, — финансирующим организациям. Но особо он отметил двоих — Джона Маккафферти, который внес основной вклад в молекулярную часть работы по созданию и селекции фаговых библиотек, и Ричарда Лернера — руководителя конкурирующей группы по разработке фагового дисплея антител в Институте Скриппса в Калифорнии.

«Несмотря на конкуренцию, мы очень благодарны группе Лернера за преодоление многих технологических проблем, с которым столкнулись при разработке фагового дисплея антител».

Антитела, как всем известно, защищают организм от разнообразных вторжений извне. Связывая антиген, антитела запускают тем самым работу нескольких защитных систем организма, от простой блокировки антигена путем образования иммунных комплексов до активации систем комплементаи антитело-зависимой цитотоксичности, а также включения более сложных путей клеточного иммунитета. Антитело состоит из константной (структурной и эффекторной) и вариабельной (антигенспецифической) частей. Вариабельный домен, в свою очередь, состоит из двух субъединиц — вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепи.

Для достижения высокой аффинности и специфичности антител в природе развились механизмы селекции и аффинного созревания. В-лимфоциты несут в себе продукты рекомбинации генов-компонентов вариабельного домена антитела (V, D, J для тяжелой цепи, V и J для легкой). За счет рекомбинации и объединения тяжелой и легкой цепи формируется высоковариабельный набор клонов В-лимфоцитов. Каждый клон кодирует уникальную последовательность антитела, при этом само антитело представлено на поверхности клетки данного клона в виде рецептора на мембране. В результате распознавания антигена клетки, несущие наиболее высокоаффиный рецептор, отбираются, а низкоаффинные элиминируются. Дальнейшее повышение аффинности в отобранных клонах B-клеток достигается благодаря соматическим мутациям в вариабельной части генов иммуноглобулинов и дальнейшей аффинной селекции. Отобравшиеся В-лимфоциты дифференцируются либо в плазматические клетки, либо в клетки памяти.

Аффинная селекция В-клеток — классический природный вариант «дисплея» антител. Присутствующее на поверхности клетки антитело (В-клеточный рецептор) отражает наличие реаранжированного гена в геноме этой клетки, и B-клетки, содержащие наиболее аффинный вариант антитела (и VDJ гена, его кодирующего) отбираются по признаку наилучшего распознавания антигена.

Природа использует антитела главным образом для борьбы с инфекциями. Человек научился создавать антитела, имеющие другую активность, например, противоопухолевую или противовоспалительную. И эти антитела можно рассматривать, как продукт искусственной селекции/эволюции – “Man-made antibodies” (термин придумал сам сэр Грегори в конце 80-х годов XX века — A. K.).

В отличие от природных, искусственно полученные терапевтические антитела используются для блокады растворимых белков и рецепторов в организме пациента либо для активации цитотоксических механизмов иммунитета с целью уничтожения патологически измененных (например, опухолевых) клеток. Успех, достигнутый в последние десятилетия в применении терапевтических моноклональных антител, таков, что шесть из десяти наиболее продаваемых медицинских препаратов — антитела.

Путь к терапевтическим антителам был долгим. В начале пути было изобретение технологии получения моноклональных антител мыши Кёлером и Мильштейном. Антитела из гибридом были настоящим прорывом в исследованиях, однако попытки их терапевтического применения закончились тяжелыми, угрожающими жизни реакциями. Многочисленные попытки тех лет создать человеческий аналог мышиных гибридом окончились неудачей. Поэтому исследователи в начале 80-х годов стали искать обходные пути. Сначала появились химерные антитела, в которых вся константная часть была взята из человеческого антитела и лишь вариабельные, антигенспецифические домены были мышиными, из гибридомы. Эти антитела успешно использовались и по сей день используются в терапии, однако далеко не все химерные антитела прошли клинические испытания из-за иммуногенности и реактогенности. Наконец, уровень белковой инженерии вырос настолько, что стала возможна гуманизация антител, «трансплантация» гипервариабельных участков мышиного моноклонального антитела в «скелет», сформированный антителом человека. Эти молекулы были человеческого происхождения уже на 95%.

А что если искусственно создать полностью человеческие антитела? И вот тут мы столкнулись с несколькими техническими проблемами. Для получения даже химерных иммуноглобулинов необходимо сначала выделить ДНК, кодирующую вариабельный домен антитела. И вот эта процедура, хотя она и кажется несложной, на самом деле была для нас большой головной болью. Дело в том, что последовательности генов антител существенно отличаются друг от друга, и какой именно вариант гена находится в данной гибридоме — неизвестно. Поэтому чтобы правильно сконструировать набор праймеров для амплификации вариабельной части гена методом ПЦР, нужно попытаться идентифицировать наиболее консервативные участки на концах генов вариабельных доменов антитела. Мы считали, что поиграв с экспериментальными условиями, возможно, сумеем создать набор праймеров для ПЦР, которые позволят амплифицировать все гены антител мыши. Это было начало эпохи ПЦР, поэтому мы столкнулись с определенными трудностями, но в конце концов такой набор праймеров нам создать удалось.

Следующим шагом группы Винтера было создание аналогичного «оптимального» набора праймеров для амплификации генов вариабельных доменов антител человека. И это дало им новые возможности. Почему бы не амплифицировать репертуар антител из селезенки или периферических лимфоцитов? А если мы можем амплифицировать репертуар антител человека, то почему бы не обойтись без иммунизации и не попробовать найти в этом репертуаре антитела к аутоантигенам? Антитела к собственным белкам или другим мишеням в организме человека могут иметь большое терапевтическое будущее.

Дальше возник вопрос о системе, в которой можно продуцировать, изучать, а затем и отбирать такие антитела. К счастью, вариабельные домены мышиных антител в нативном правильно сложенном виде успешно производились в периплазме E. coli. В итоге группа Винтера получила рекомбинантные антигенспецифические вариабельные фрагменты антител. Такие же результаты получила и группа Лернера.

Но без иммунизации антигенспецифические антитела в рекомбинантном репертуаре обнаружить не удавалось — система селекции была недостаточно совершенной. И тогда мы обратились к механизму селекции антигенспецифических В-лимфоцитов в организме и задали себе вопрос: можем ли мы найти ему замену в пробирке?

После мозгового штурма вопрос о выборе системы селекции решился в пользу фагового дисплея. Другие системы дисплея, которые к тому моменту уже зарождались или были проработаны концептуально, были отвергнуты, в первую очередь из-за недостаточного размера библиотеки антител, создаваемой с их помощью. При участии «трёх F» и компании Пептек из Австралии была создана компания «CAT», в которой ключевые должности занимали сам Винтер, Джон Маккафферти и Дэвид Чизвелл. Поскольку четырьмя годами ранее Смит показал, что можно эффективно подвергать дисплею пептиды, используя нитевидные бактериофаги, исследователи остановились на этой технологии, обеспечивающей большой размер исходной библиотеки. Но оставался вопрос: не будут ли антитела мешать инфекционности бактериофага?

Для проверки была создана модель фагового дисплея на основе антитела к куриному лизоциму. Экспонированный на поверхности фага антигенспецифический фрагмент антитела не мешал инфекции. Используя фаговую ELISA, исследователи показали, что связывание с фагом специфично, в частности, куриный лизоцим связывает фаг, а лизоцим индюшки с фагом не взаимодействует. Эксперименты с аффинной селекцией, в которой фаг, несущий антитело, смешивался с очень большим избытком фага дикого типа, показали, что за один раунд селекции можно достичь обогащения целевым фагом примерно в 1000 раз, за два — в миллион раз.

Нам сильно повезло в том, что фрагменты антител экспрессировались на поверхности фага в правильно сложенном состоянии — а ведь этого могло и не случиться.

В сконструированных библиотеках антител фрагменты легких и тяжелых цепей объединялись произвольно, так что процент нативных пар цепей был исчезающе мал. Однако новые комбинации были интересны, потому что могли дать антитела к аутоантигенам, клетки-продуценты которых в организме удалялись иммунной системой. Модельная библиотека содержала антитела к хорошо известному высокоиммуногенному гаптену — 2-фенил оксазолону. Это тот самый антиген, который использовал Мильштейн для изучения гибридом. Из библиотеки удалось выделить специфичные антитела. Их аффинность не уступала антителам из гибридомы.

Мы получили селезенку мыши и разделили ее на две части. Одна использовалась для создания библиотеки, а из другой половины Мильштейн приготовил гибридомы. А потом мы сравнили аффинность лучших «библиотечных» и «гибридомных» антител, и она оказалась одинаковой.

Сложнее было получить антигенспецифические антитела человека, не прибегая к иммунизации. Первая такая библиотека содержала около 10 млн клонов. И вот из нее были выделены антитела ко многим антигенам, в том числе и аутоантигенам человека. Однако аффинность этих антител была слишком низкой — в миллимолярном диапазоне. Методики повышения аффинности испытывали на все том же 2-фенилоксазолоне: мимикрируя процессы в В-клетках, использовали штамм E. coli, который вносит в ДНК спонтанные мутации, и получили 300-кратное увеличение аффинности. Исследователям удалось даже построить генеалогическое древо мутаций, в котором выделялись 4 изменения в ДНК, и каждое из них способствовало последовательному повышению аффинности. Работали и над методами повышения аффинности антител. Помимо ужесточения условий селекции путем уменьшения концентрации антигена-«приманки», научились менять и формат фагового дисплея. Обычно фаг несет 5–6 молекул белка pIII, содержащих молекулы антител. Однако, если по методике, которую придумал Джеймс Уэллс, использовать не фаг, а упакованную фагемиду, на ее поверхности будет не более одной копии pIII, а остальные копии будут получены от фага-помощника. Этот подход также ужесточает условия отбора, снижая авидность фаговой частицы.

На основе всех этих модификаций была сконструирована полностью синтетическая библиотека антител человека, в которой содержалось 10 млрд клонов. Для этого пришлось просеквенировать все V, D и J-гены человека, составляющие вариабельный фрагмент антитела: в1990-е годы большинство этих последовательностей были неизвестны.

И вот когда эту библиотеку проскринировали против аутоантигенов человека, были впервые получены антитела с аффинностью в наномолярном диапазоне. Фактически, используя такую очень большую библиотеку, мы избежали необходимости длительного аффинного созревания антител. Что особенно хорошо – из такой очень большой библиотеки можно выловить антитела к всевозможным видам мишеней.

Однако для получения первого в истории синтетического терапевтического антитела к ФНО-альфа, известного как адалимумаб (Humira) и применяющегося теперь для лечения ревматоидного артрита, аутоиммунного цирроза печени и болезни Крона, не хватило и этой библиотеки. И тогда мы взяли антитело мыши к ФНО-альфа и заменили в нем легкую цепь на библиотеку легких цепей синтетического репертуара антител человека. Когда из библиотеки с заменой отобрали антитела, специфичные к ФНО-альфа, у них аналогичным образом заменили и фрагмент тяжелой цепи, а затем повторили отбор. И это привело к успеху.

Компания CAT в сотрудничестве с Medimmune из библиотеки в 100 млрд клонов создала десятки антител к различным терапевтическим мишеням. Из них более 60 находятся на стадии клинических испытаний.

«Таким образом, вы можете видеть, что технология дисплея антител на поверхности нитевидного фага стала исключительно мощным способом использования эволюционного подхода для создания новых терапевтических препаратов», — сказал в заключение сэр Грегори Винтер.