Нобелевская неделя 2020. Чарльз Райс: «Значительные успехи, которые сделаны с изначально мистическим вирусом»

Перед своей лекцией Чарльз Райс поблагодарил Нобелевский комитет за награду и возможность представить результаты работы многих исследователей.

Райс начал лекцию с исторической справки про открытие гепатитов: в 17–19 веках были описаны вспышки желтухи, особенно во время войн. В 30-е годы 20 века желтуха иногда развивалась после введения вакцины против желтой лихорадки, в состав которой помимо аттенуированного вируса входила человеческая сыворотка. В конце 30-х обнаружили связь между развитием гепатита и сывороткой, а в 40-х описали два вида: инфекционный и ассоциированный с сывороткой гепатиты. В 1965 году Блумберг открыл поверхностный белок вируса гепатита B (HBV), что стало основой для разработки вакцины. С помощью иммуноэлектронной микроскопии в 1973 году описали частицы вируса гепатита А (HAV). Также в начале 70-х стало ясно, что в 10% случаев после переливания крови гепатит вызывался не HAV и не HBV, его назвали «гепатит ни А, ни В» (NANBH). Этот тип гепатита был хроническим, мог приводить к фиброзу и циррозу печени, им удалось заразить шимпанзе с использованием сыворотки от пациентов. В середине 70-х стало понятно, что возбудитель — вирус, который можно было отфильтровать и который имел оболочку: его можно было инактивировать с помощью органических растворителей.

Структура генома HCV

От исходного описания до определения вируса прошло почти 15 лет, и в 1989 году в Science вышла статья Майкла Хоутона, в которой представлены результаты скрининга колоний, экспрессирующих фрагменты кДНК вируса, и поиска тех, которые распознавались антителами из сыворотки пациентов.

«Меня зацепило в абстракте этой статьи то, что это была позитивная цепь РНК, и вирус был, вероятно, связан с семейством флавивирусов», — говорит Райс. Была также описана структура генома вируса, состоящего из 10 тыс. п. н.

«В 1989 мы изучали вирус из этого семейства — вирус желтой лихорадки (YFV). Однажды мне в лабораторию позвонил Стив Файнстоун, который участвовал в открытии HAV и в исследованиях NANBH на шимпанзе. И вот он, как гром среди ясного неба, говорит: “Привет, Чарли! Что насчет того, чтобы сделать вакцину из химеры YF17D/HCV?”»

В то время группа Райса получила сиквенсы штамма вакцины YF17D, ее родительского штамма (Asibi) и разработала клон YF17D, способный к инфекции, который дал исследователям возможность работать с геномом вируса на уровне ДНК и изучать эффекты мутаций на жизненный цикл вируса. Также они сделали вывод, что YF17D можно использовать как носителя иммунореактивных эпитопов других агентов. Это и привлекло внимание Стива Файнстоуна.

Было неясно, как происходит экспрессия генов HCV в клетках. При этом в мире было более миллиона инфицированных. Было также показано, что инфекция может быть бессимптомной, хронической и приводить к развитию цирроза и других серьезных заболеваний печени. Так, было поставлено несколько целей для борьбы с вирусом: очищение образцов крови, обучение групп с повышенным риском инфекции или разработка вакцины, диагностика инфекции, разработка лечения и полное избавление от вируса. При этом, на тот момент не удавалось стабильную реплицировать вирус в клеточной культуре, и, кроме шимпанзе, не было животной модели.

Частично была описана структура генома вируса: на 5’-конце находится вторичная структура, которая служит инициатором трансляции, после которой идет длинная область, кодирующая более 3 000 аминокислот. Один из сотрудников лаборатории Райса, Араш Гракуи, работал над тем, чтобы понять, какие белки и как синтезируются в этой длинной открытой рамке считывания. Он и другие исследователи показали, что геном кодирует 10 белков, 5 из которых — структурные, образующие вирусные частицы, а 5 других участвуют в репликации вируса. Также они описали протеазы, необходимые для получения белков, и границы генов этих белков. Это позволило определить возможные мишени для препаратов: комплекс NS3-4A и NS5B — РНК-зависимая РНК-полимераза. При этом на тот момент у исследователей не было возможности доказать важность событий расщепления белков для репликации вируса.

Далее Райс рассказал, зачем нужно получать инфекционные клоны РНК-вирусов. Так, при инфицировании восприимчивых клеток настоящим вирусом РНК транскрибируется, клетки продуцируют дочерние вирусные частицы. В случае (+)РНК-вирусов, таких как HCV и SARS-CoV-2, если в цитоплазму клеток ввести только РНК вируса, она будет работать, запуская жизненный цикл вируса. Вирусологи получают комплементарную РНК вируса ДНК, в которую можно вводить любые интересующие исследователей изменения. От этой кДНК можно затем in vitro получать работающие РНК, мимикрирующие вирусный геном.

Ученые планировали сделать подобное с HCV, взяв за основу высокоинфекционный штамм H77 («пациент H»). Используя кДНК, они in vitro получили РНК HCV и безуспешно пытались инфицировать ей клеточные культуры. При введении этой РНК в печень шимпанзе также ничего не происходило, хотя сам принцип моделирования гепатита с помощью введения синтетической РНК HAV в печень работал на мармозетках.

Группа Райса начала копать глубже в структуру генома HCV. Для разных клонов HCV были получены противоречивые данные: на 3’-конце РНК находили либо поли(А)-, либо поли(U/UC)-хвост. При этом было известно, что на конце РНК вируса желтой лихорадки не было этих хвостов: она оканчивалась шпилечной структурой. Один из сотрудников лаборатории, Александр Колыхалов, который иммигрировал в США из Новосибирска, разработал методику для более точного анализа 3’-конца. Оказалось, что после стоп-кодона находится гипервариабельная область, образующая шпильку, далее — поли(U/UC)-участок, длина которого также варьирует, после которой — консервативный элемент из 98 пар оснований. Подобные элементы нужны для нормальной репликации РНК вирусов. Подобная структура была описана и в лаборатории Кунитады Шимотоно (Kunitada Shimotohno). Однако попытки инфицировать клеточные культуры или шимпанзе синтетической РНК с правильной структурой 3’-конца также не увенчались успехом.

«Мы были не уверены во всем: может ошибка была в процессе введения РНК в печень животных? Или были до сих пор неизвестные участки генома? Или эта РНК в принципе не была способна инфицировать клетки? Может для исходной репликации в клетке нужен был некоторый вирусный белок или модификации РНК, которые попадали в клетку только в составе вирусной частицы, но не в случае синтетической РНК? Мы знали, что вирус сильно подвержен ошибкам: по некоторым оценкам, у отдельного индивидуума может образовываться до триллиона вариантов в сутки, часть из которых могут быть смертельными. Также в то время ферменты, которые мы использовали для синтеза кДНК и клонирования, были менее точными, чем сегодня».

Синтетическая РНК HCV и субгеномные репликоны

Чтобы решить часть этих проблем, Александр Колыхалов создал библиотеку из нескольких геномов, из которых собрал консенсусную последовательность, включившую наиболее часто встречающиеся участки. Исследователи не были полностью уверены в некоторых нуклеотидах 5’-конца, а также в длине поли(U/UC)-участка, поэтому они протестировали 10 вариантов РНК с разными нуклеотидами и разной длиной участка. При участии Стива Файнстоуна они ввели их в печень двум шимпанзе, в одном случае с использованием липофектина для повышения эффективности попадания РНК в клетки. У обеих обезьян в крови обнаруживалась РНК HCV, повышался уровень аланинаминотрансферазы, показывающий воспаление в печени. Впоследствии у животных развилась хроническая инфекция, что подтвердило работу синтетической РНК, вне зависимости от присутствия дополнительных нуклеотидов на 5’-конце и длины поли(U/UC)-участка. Практически в это же время вышла еще одна подобная работа.

«Это удовлетворяло постулатам Коха: у нас была изолированная последовательность, собранная синтетически, которая была способна инициировать инфекцию и приводить к развитию болезни. У нас появилась возможность клонально инфицировать обезьян, за счет чего можно изучать эволюцию вируса, ответ хозяина и важность потенциальных терапевтических мишеней. Например, мы могли ввести мутации в гены вирусных протеаз и показать, что они абсолютно необходимы для инфицирующей способности. То же самое для РНК-репликазы. В конце концов, мы получили функционирующую, жизнеспособную последовательность генома HCV, которую мы могли размножить». Однако у исследователей вновь не получилось заразить этими РНК клетки в культуре.

Прорыв случился, когда немецкие исследователи создали субгеномный репликон: они заменили гены структурных белков на ген устойчивости к неомицину со своим сайтом инициации трансляции. С помощью электропорации они ввели РНК в клетки гепатокарциномы (Huh7) и провели селекцию антибиотиком G418. В устойчивых клонах наблюдалась стабильная репликация модифицированной РНК HCV. На этой модели начали проверку ингибиторов вирусных протеаз, РНК полимеразы. Однако эффективность получения устойчивых клонов была низкая (1 из 1 млн.).

Секвенирование РНК из устойчивых клонов показало, что молекула успела накопить адаптивные мутации, которые повысили способность заражать клетки в сравнении с исходной РНК. Эта способность также повысилась после обработки клеток интерфероном. Это привело к более эффективной трансдукции, возможности более подробно изучать генетику HCV и получать разные варианты репликонов с репортерными генами для скрининга, а также появилась возможность изучать лекарства.

Используемые репликоны не давали полный цикл репликации вируса, так как в их составе не было некоторых генов HCV. Исследователи ввели подобные адаптивные мутации в исходную последовательность, однако клетки все равно не продуцировали вирусные частицы. Японский исследователь Такаджи Вакита выделил штамм вируса (JFH1), который вызвал острый гепатит у пациента, и сделал из него репликон. Из клеточных культур, инфицированных этим репликоном, удалось получить собранные вирусные частицы, которые были способны заражать шимпанзе и мышей с гуманизированной печенью.

«Это был первый раз, когда мы получили полную систему репликации вируса, более чем через 15 лет после его открытия. Он сильно отличался от большинства вирусов человека, с которыми мы работали. Наступил золотой век исследований HCV: мы могли анализировать весь жизненный цикл вируса, посмотреть на его взаимодействие и сборку в мембранах, изучить врожденный и адаптивный иммунный ответ, придумать способы нейтрализации, в том числе для разработки вакцины. В то время мы также поняли, что HCV и подобные вирусы не были редки и часто встречались у других видов в природе. Сейчас HCV — наиболее полно изученный (+)РНК-вирус, который только SARS-CoV-2 может переплюнуть со всеми событиями в его области». Райс показал видео того, как вирус распространялся в культуре клеток.

История лечения HCV-инфекции

Далее Райс рассказал о вариантах лечения HCV-инфекции. Так, исследователи знали, что вирус не интегрируется в геном клеток, остается в цитоплазме, у некоторых пациентов удалось полностью убрать вирус. Также появились доказательства того, что если убить вирус, то можно снизить риск развития заболеваний печени.

В начале 90-х пациентов лечили интерфероном первого типа, эффективность избавления от вируса составляла 16%. Далее его комбинировали с рибавирином и использовали более стабильный интерферон (PegINF). В 2011 году впервые были одобрены ингибиторы протеаз (телпаревир, боцепревир), они повысили эффективность, но давали побочные эффекты. А в 2014 году от интерферонов отказались полностью — в это время противовирусные препараты прямого действия стали давать 95% эффективность. Мишени таких препаратов — протеаза NS3, РНК-репликаза NS5B и белок NS5A, который участвует в репликации вируса и сборке частиц. С помощью этих препаратов от вируса можно избавиться за 2–3 месяца. «Вирус сильно вариабельный. Но эти новые препараты работают практически против всех его вариантов».

«Это значительные успехи, которые сделаны с изначально мистическим вирусом с 70–80-х. В 1989 его определили, в 2011 выпустили первые антивирусные препараты с эффективностью около 75%, а в 2015 — еще более эффективные препараты».

Также Райс описал некоторые проблемы, которые до конца не решены. Для полного уничтожения вируса важно выявить всех инфицированных, но часто инфекция протекает бессимптомно. Тех, кого выявляют, нужно лечить, а для этого надо сделать лечение более доступным по всему миру. Также нужно работать с некоторыми группами пациентов, которые плохо поддаются лечению (например, коинфицированные HAV/HCV). С точки зрения устойчивости вируса препараты достаточно эффективны, но вакцины до сих пор нет. «Я надеюсь, что мы что-нибудь усвоим из всех тех усилий, с которыми разрабатывается вакцина от COVID-19, что может пригодиться при создании вакцины от гепатита C».

«Это был долгий путь, в который было вовлечено множество людей: исследователи, клиницисты, люди из биотеха и фармы, те, кто проводил клинические испытания, сами пациенты. Я рад, что работал в этой команде».

В конце Райс поблагодарил родителей, друзей, менторов, которые привели его в науку, сотрудников и соавторов, а также своего партнера Маргарет МакДоналд.

Посмотреть на PCR.news лекцию Майкла Хоутона.

Посмотреть на PCR.news лекцию Харви Альтера.