Кросс-сшивки в ДНК-вставке повышают эффективность редактирования генома

Ученые из США предложили способ повысить эффективность редактирования генома, опосредованного системой CRISPR-Cas9.

Нуклеаза Cas9 вносит двунитевой разрыв в заданном участке ДНК. На место разрыва можно вставить новую последовательность, но для этого в клетку нужно внедрить соответствующую ДНК-матрицу. Один из способов — совместная доставка Cas9, гидовой РНК и ДНК-вставки. Вставка содержит участки, гомологичные последователям в месте разрыва. Наиболее выгодна в таком случае починка разрыва с помощью гомологичной рекомбинации (homology-directed repair, HDR), в процессе которой на поврежденное место встает новая матрица. Перспективными для биотехнологии считаются стратегии, направленные на повышение частоты HDR.

Авторы новой работы исходили из установки, что запустить желаемый путь репарации ДНК после работы Cas9 можно, добавляя субстрат, наиболее подходящий для этого пути. Ранее было показано, что при редактировании генома с помощью CRISPR-Cas9 без вирусных векторов задействуется сигнальный путь анемии Фанкони (FA), одна из функций которого — удаление кросс-сшивок ДНК. Оверэкспрессия компонентов FA не повышает частоту HDR, поэтому ученые решили использовать в качестве вставки двухцепочечные молекулы ДНК с кросс-сшивками (xHDRT). Эксперименты проводились на человеческих клеточных линиях.

На первом этапе ученые вносили кросс-сшивки в HDRT с помощью псоралена и цисплатина. Оба подхода стимулировали HDR. Для дальнейших опытов был выбран псорален, так как он активируется только при облучении ультрафиолетом, и не прореагировавший псорален в дальнейшем остается неактивным. Использование xHDRT с псораленовыми кросс-сшивками в три раза повысило частоту встраивания гена GFP в локус HBB клеток миелоидного лейкоза K562.

Плотность псораленовых кросс-сшивок зависит от содержания TA в ДНК, концентрации псоралена и параметров УФ-облучения, а значит, на нее влияет в том числе тип HDRT. Ученые разработали анализ на основе количественной ПЦР для определения числа кросс-сшивок в заданной молекуле ДНК и рассчитали их оптимальную плотность. Она составила около 60 кросс-сшивок на одну xHDRT.

На следующем этапе авторы показали, что xHDRT повышают эффективность редактирования генома в клетках K562 независимо от того, доставляются они в составе линейных или кольцевых молекул, используется GFP или другой репортер и пришиваются ли к репортеру другие последовательности. После этого они протестировали xHDRT на человеческих клетках других типов. Кросс-сшитые HDRT в два раза увеличивали частоту HDR в клетках U2OS и HEK293T по сравнению с обычными HDRT, а также стимулироваил HDR в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках.

Возможность терапевтического применения xHDRT проверили на T-клетках. При концентрации 500 нг xHDRT на реакцию итоговое количество отредактированных клеток было в 3,8 раз выше, чем при использовании обычной матрицы в такой же концентрации. Ограничивающими факторами оказались токсичность электропорации и матрицы — это не позволяло увеличивать концентрацию xHDRT.

Мутагенность xHDRT была не выше, чем у обычных HDRT, то есть кросс-сшивки не снижали точность гомологичной рекомбинации. Ученые показали, что xHDRT активирует механизмы FA-репарации локально, их внесение не сказывается на репарации всей ДНК клетки. Чтобы уточнить механизмы распознавания и обработки кросс-сшитой матрицы, они ингибировали различные белки, вовлеченные в репарацию ДНК. Оказалось, что процессинг xHDRT опосредован киназой ATR, а за повышение частоты HDR в случае кросс-сшивок отвечает активация гетеродимера FA-белков FANCD2-FANCI.

Для более точного описания механизма гомологичной рекомбинации с xHDRT необходимы дальнейшие исследования. С практической точки зрения использование xHDRT повышает эффективность HDR в разных типах клеток. Разработка этого подхода в перспективе сделает производство терапевтических клеток ex vivo более быстрым и выгодным.

Электропорация CRISPR-Cas9 и одноцепочечной ДНК упростила редактирование клеточных геномов