Синтетические пептиды усиливают иммунотерапию за счет активации врожденного иммунитета

Активация врожденного иммунитета в антигенпрезентирующих клетках (АПК), например, в макрофагах или дендритных клетках, может улучшать их способность к распознаванию и фагоцитозу опухолевых клеток. Однако опухолевое микроокружение способно подавлять иммунный ответ и снижать воспаление, затрудняя работу АПК. Решить эту проблему можно за счет стимуляции путей врожденного иммунитета, таких как cGAS—STING или TLR9. Для этого используют естественные агонисты этих сенсоров — двухцепочечную ДНК или циклические нуклеотиды. Однако они нестабильны в сыворотке крови, легко разлагаются ферментами и с низкой эффективностью доставляются в клетки. Ученые из США предложили альтернативный подход для активации путей врожденного иммунитета в АПК — использование искусственных пептидов.

Исследователи синтезировали ряд полипептидов и оценили их влияние на пути врожденного иммунитета в зависимости от структурных характеристик — гидрофобности, электростатического заряда, длины. Выбрав лучший пептид, ученые оценили его распределение в тканях и токсичность с использованием мышиных моделей. Затем в ряде in vitro и in vivo тестов на клетках и на мышах они определили механизм действия пептида и его противоопухолевое действие как в виде монотерапии, так и в комбинации с ингибиторами контрольных точек иммунитета.

Среди синтезированных учеными полипептидов самыми перспективными оказались гидрофильные и поликатионные пептиды с разветвленной структурой боковых цепей и с циклическими аминами в составе. Такие пептиды наиболее эффективно способствовали высвобождению митохондриальной ДНК в ответ на стресс эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в АПК. Среди кандидатов ученые выбрали один из пептидов, P1, обладающий спиральной структурой и наиболее стабильный в сыворотке крови. При введении этого пептида мышам с раком молочной железы (клеточная линия EO771) он накапливался в области опухоли, причем в основном его захватывали CD45⁺ иммунные клетки, в том числе макрофаги и дендритные клетки, а не клетки эпителия. P1 не был токсичным ни для АПК, ни для раковых клеток сам по себе. При этом он увеличивал выживаемость мышей с опухолью молочной железы и подавлял рост опухоли в дозировках вплоть до 20 мг/кг. Это достигалось за счет того, что поглотившие пептид АПК эффективнее активировали Т-клетки: вблизи опухоли увеличивалось число CD8⁺ Т-клеток, продуцирующих IFNγ. Противоопухолевое действие пептида P1 оказалось более выраженным по сравнению с двумя другими агонистами путей врожденного иммунитета — олигонуклеотидами с CpG-островками и циклическим ГМФ—АМФ (цГАМФ), которые напрямую активируют сигналинг TLR9 и cGAS—STING.

Исследователи доказали, что пептид P1 влияет специфически на АПК. Так, в макрофагах он повышал экспрессию генов, характерных для фенотипа M1 и ассоциированных с интерфероновым ответом типа 1, а в дендритных клетках способствовал экспрессии провоспалительных цитокинов. P1 активировал в АПК оси cGAS—STING—IRF3, MyD88—IRF7, а также сигнальный путь NF-кB, внося вклад в провоспалительный ответ АПК через несколько независимых путей.

Более подробный анализ показал, что P1 попадает внутрь АПК в составе лизосом, но потом физически разрушает их мембраны и накапливает в ЭПР. Это приводит к стрессу ЭПР, повышению уровня активных форм кислорода (АФК) и выбросу в цитоплазму митохондриальной ДНК. Она, в свою очередь, активирует путь cGAS—STING и сигналинг TLR9. Исследователи доказали это в экспериментах с АПК, нокаутными по MyD88, STING, cGAS или TLR9. При нокауте этих компонентов врожденного иммунитета провоспалительный эффект P1 снижался. Также P1 способствовал образованию NLRP3 инфламмасомы и продукции IL-1β, что является следствием активации cGAS—STING и TLR9.

Эксперименты на клетках, где макрофаги или дендритные клетки культивировались вместе с клетками рака молочной железы, показали, что P1 стимулирует фагоцитоз опухолевых клеток АПК. Это облегчает антигенпрезентацию и кросс-презентацию опухолевых антигенов Т-клеткам. При инкубации макрофагов и дендритных клеток, которые ранее растили вместе с раковыми клетками и стимулировали P1, с CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитами, пролиферация последних значительно повышалась. При этом лимфоциты переходили к фенотипам памяти.

Известно, что опухоли могут приобретать резистентность при активации врожденного иммунитета за счет экспрессии молекул контрольных точек иммунитета. Так, обработка клеток пептидов P1 приводила к повышению экспрессии PD1 в АПК и Т-клетках и PD-L1 — в опухолевых клетках. Чтобы преодолеть эту резистентность, ученые решили совместить P1 и ингибитор взаимодействия PD1/PD-L1 — антитело к PD1 (αPD1). Такая комбинация лучше подавляла рост опухоли и продлевала выживаемость мышей с ксенографтами, чем каждый из препаратов по отдельности, даже если опухоль была крупной. Благодаря синергическому эффекту P1 и αPD1 в опухоль привлекалось больше иммунных клеток, в особенности зрелых дендритных клеток, M1 макрофагов и CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток. При этом АПК все так же активировались через пути врожденного иммунитета и затем активировали Т-клетки. В целом комбинация P1 и αPD1 способствовала появлению более сильного и системного антиопухолевого иммунного ответа.

Пути врожденного иммунитета оказались необходимыми для работы P1 и αPD1. Так, эффективность комбинированной терапии снижалась в клетках с нокаутом по STING, MyD88 или TLR9, а также при искусственном истощении АПК у мышей с опухолями. В отсутствие АПК микроокружение опухолей животных подавляло иммунитет за счет рекрутинга Т-регуляторных клеток. Если животных лишали CD8⁺ Т-клеток, то даже при наличии АПК терапия также оказывалась неэффективной. Это доказало, что для работы P1 и αPD1 необходима активация АПК и цитотоксических Т-клеток.

Исследователи также показали, что сочетание P1 и αPD1 эффективно для борьбы с агрессивными метастазами. В качестве модели они использовали мышей, которым импланировали клетки рака молочной железы 4T1-BR4, помеченные люциферазой. У таких мышей появлялись метастазы в мозге. Комбинация препаратов подавляла метастазы, и в 25% случаев удавалось добиться полной ремиссии, а выживаемость мышей составила 150 дней. Аналогичным образом ученым удалось повысить выживаемость мышей в модели спонтанных метастазов.

Таким образом, авторы работы показали, что синтетические полипептиды, активирующие пути врожденного иммунитета, могут быть эффективны как в монотерапии, так и в комбинации с ингибиторами контрольных точек иммунитета в животных моделях рака молочной железы. Однако такой подход редко позволял полностью избавиться от опухоли, хотя и оказался перспективным в борьбе с метастазами. Ученые планируют и далее модифицировать пептиды на основе их физико-химических свойств, чтобы увеличить их терапевтический потенциал.

Модифицированные частицы растительного вируса предотвращают образование метастазов у мышей