Внеклеточные везикулы раковых клеток выделили с помощью нанобумаги

Внеклеточные везикулы (ВВ) секретируются всеми живыми клетками и играют важную роль в межклеточной коммуникации. Помимо здоровых тканей, ВВ также обнаруживаются в микроокружении опухолей. Однако изучение разнообразия ВВ при разных видах рака ограничено тем, что для их анализа требуется большой объем биологических жидкостей, содержащих ВВ. Японские ученые предложили решение этой проблемы. Они разработали бумагу из целлюлозных нановолокон (нанобумагу), позволяющую сорбировать ВВ из жидкости объемом 10 мкл, в том числе распределенной по поверхности органа. Так, нанобумагу можно прикрепить к увлажненной поверхности органа за счет капиллярных сил во время операции и зафиксировать ВВ, которые затем извлекают с помощью буферного раствора и анализируют.

Нанобумага имеет поры размером 300 нм. На нее наносят биологическую жидкость, содержащую ВВ, а потом высушивают, результате чего поры уменьшаются до 10 нм. После этого нанобумагу можно хранить при комнатной температуре семь дней. Десятисекундное промывание нанобумаги в фосфатно-солевом буфере способствует намоканию поверхности и очищению ее от загрязнений, при этом ВВ остаются внутри пор. Выдерживание нанобумаги в буфере в течение пяти минут способствует расширению пор до 300 нм и высвобождению ВВ.

В первую очередь нанобумагу протестировали на сыворотке крови объемом 10 мкл. В исследуемом образце были обнаружены везикулы диаметром 40–300 нм, покрытые липидным бислоем и несущие на поверхности маркерные молекулы CD63. После высушивания и регидратации сохранялось до 100% исходного количества везикул (до 10⁹ частиц). Высушенный образец мог храниться по меньшей мере 90 дней. Кроме того, этим методом удалось получить более высокую концентрацию везикул из объема 10 мкл, чем при центрифугировании 250 мкл сыворотки.

Далее проводили анализ микроРНК везикул из сыворотки крови. Для этого высушенные образцы помещали в лизирующий раствор, а затем секвенировали выделенные микроРНК. Высушивание образцов в течение семи дней приводило к лучшему прочтению, чем сушка в течение одного дня, поэтому в дальнейшем на высушивание образцов перед проведением анализа отводилась неделя.

Поскольку нанобумага позволяет выделять ВВ из небольшого объема жидкости, ее использовали для получения ВВ с поверхности органов мышей с низким объемом асцитической жидкости. После сбора и высушивания ВВ авторы провели секвенирование микроРНК в образцах, полученных с поверхности печени и брюшины. Сравнительный анализ показал, что в этих органах были как универсальные микроРНК, так и дифференциально экспрессируемые: 12 микроРНК экспрессировались в большом количестве на поверхности печени, но не брюшины.

Также с помощью целлюлозной нанобумаги анализировали ВВ в асцитической жидкости у мышиной модели рака яичников. Мышам внутрибрюшинно вводили клетки карциномы яичника (ID8). Обычно у таких моделей асцитическая жидкость накапливается к четвертой неделе, но в данном случае образцы собирали через 14 дней после введения клеток ID8, когда еще не было явного асцита. Было обнаружено, что профили микроРНК везикул значительно различаются у опытных животных и у контрольных здоровых мышей. При введении раковых клеток в бурсу яичника профили микроРНК везикул отличались от исходных показателей уже на четвертый день. Этот опыт демонстрирует возможность применения данного метода уже на ранних стадиях заболевания.

Эффективность нового метода была продемонстрирована также для человеческих тканей ex vivo. ВВ были отобраны с поверхности удаленной опухоли яичника, а также из сыворотки, мочи и асцитической жидкости той же пациентки. Профили микроРНК везикул значительно отличались в образцах, взятых с поверхности опухоли, от образцов асцитической и других жидкостей организма. При этом профиль микроРНК везикул с поверхности опухоли был ближе к профилю опухоли, чем к профилю асцитической жидкости.

Авторы исследования определили биомаркеры раковых заболеваний на разных стадиях, используя предложенный ими метод. Они показали, что опухоли на ранних и поздних стадиях, а также метастазы, имеют различные профили микроРНК везикул. Кроме того, профили микроРНК в сыворотке и моче изменяются после хирургического удаления опухолей.

Таким образом, ученые разработали метод выделения и анализа внеклеточных везикул при низком доступном объеме жидкости, с помощью которого были обнаружены новые биомаркеры раковых заболеваний.

Белки внеклеточных везикул можно использовать для диагностики рака яичников