Тезаурус

Изотермическая амплификация SmartAmp — технология, разработанная в институте RIKEN и компании Dnaform  (Mitani, 2007). SmartAmp обеспечивает амплификацию ДНК в изотермических условиях с использованием набора асимметричных праймеров и ДНК-полимеразы Aac, способной вымещать цепь из дуплекса без расплавления ДНК. Метод не требует очистки ДНК и демонстрирует высокую чувствительность, до одного нуклеотида, что позволяет идентифицировать однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и мутации и другие мишени ДНК.

Как и LAMP, реакция проходит при постоянной температуре (60-67°C), что означает простую и более дешевую, чем термоциклеры, аппаратуру. В сочетании с обратной транскрипцией может использоваться для выявления молекул РНК.

Процесс требует праймеров четырех видов. С одной стороны от таргетного участка находятся загибающийся праймер (turnback primer, TP) с самопраймирующимися петлеобразующими мотивами (свободный 5’-конец праймера комплементарен участку «ниже по течению») и внешний праймер, функция которого — вытеснять новую нить из дуплекса, как в процессе LAMP. С другой стороны находится складывающийся праймер (folding primer, FP) со шпилькой на 5'-конце. Кроме того, применяются буст-праймеры (BP) которые необходимы для ускорения процесса, но могут также использоваться для повышения точности распознавания таргетного участка.

Для визуализации результатов амплификации авторы метода разработали флуоресцентные зонды «Eprimer & Eprobe» различных цветов. Это олигонуклеотид с экситон-контролируемой флуоресценцией, чувствительной к гибридизации (ECHO): его группы интеркалируют между парами оснований в двойной спирали. В одноцепочечном состоянии Eprimer две идентичных флуоресцентных группы не излучают из-за гашения (экситонного взаимодействия). Однако в двухцепочечном состоянии, когда праймер взаимодействует с таргетной последовательностью, интеркалирующие группы разделяются в пространстве, и возникает флуоресценция.

Преимущества метода перед классической LAMP — высокая чувствительность, позволяющая детектировать однонуклеотидные замены, улучшенное соотношение сигнал/шум и простота подбора праймеров, поскольку в SmartAmp только один TP.