Платформа для секвенирования пептидов скоро будет доступна для предзаказа

На конференции J.P. Morgan Healthcare 2022 генеральный директор компании Quantum-Si Джон Старк сообщил о скором старте предзаказов на платформы для секвенирования единичных пептидных молекул. Принцип работы основан на детекции флуоресценции в нанообъеме. Пока платформа способна идентифицировать только семь аминокислот из 20, что, однако, позволяет по характерным пептидам определить более 95% белков всего протеома человека.

Credit:
Eraxion | 123rf.com

Возможность прямого секвенирования белков активно обсуждается в последние годы. Сейчас для протеомных исследований используют масс-спектрометрию — довольно дорогой метод, не допускающий изучения единичных молекул. Были предприняты попытки использовать нанопоры для секвенирования белков, однако на настоящий момент рабочей технологии нет, в первую очередь из-за сложной вторичной структуры белков, которая затрудняет протаскивание белка через нанопору. Исследователи компании Quantum-Si создали технологию секвенирования пептидов с помощью белков, связывающих N-концевую аминокислоту исследуемого пептида. В препринте, опубликованном на biorxiv 10 января, авторы описали принцип работы новой платформы.

Технология основана на использовании набора флуоресцентно меченых белков, специфично связывающих N-концевые аминокислоты секвенируемого пептида, и аминопептидаз, последовательно отщепляющих эти N-концевые аминокислоты. Все они находятся в одном реакционном растворе, а исследуемый пептид иммобилизован в реакционной камере. Полупроводниковый чип детектирует флуоресценцию в нанообъеме и на основе интенсивности и времени флуоресценции после возбуждения лазером, а также кинетики связывания, определяет очередную аминокислоту в пептиде. Авторы не использовали длину волны испускания для различения аминокислот, так как в этом случае в конструкцию чипа должен входить оптический фильтр, не позволяющий детектировать испускаемый свет с нужной эффективностью. Объем реакционной смеси очень мал, менее 5×10-18 л, что позволяет исключить случайную детекцию флуоресценции белков, не связанных с пептидом.

В качестве белков, связывающих N-концевую аминокислоту секвенируемого пептида, авторы использовали модифицированную версию убиквитинлигазы Kluyveromyces lactis UBR1 для распознавания аргинина и две модифицированные версии белков семейства ClpS2 Agrobacterium tumefaciens — одну для узнавания фенилаланина, тирозина и триптофана, а другую для узнавания изолейцина, лейцина и валина. Каждый из этих белков мечен своей флуоресцентной меткой. Аминокислоты, узнаваемые одним и тем же белком, различают благодаря разной кинетике связывания. Для последовательного отщепления аминокислот использовали аминопептидазы PhTET2 и PhTET31, которые суммарно способны отщеплять любую из 20 аминокислот.

Работу платформы авторы продемонстрировали на примере нескольких синтетических пептидов. Так, пептид DQQIASSRLAASFAAQQYPDDD был прочитан до 18-й аминокислоты, то есть до последней распознаваемой системой аминокислоты — тирозина. Когда на N-конце оказывается аминокислота, пока не распознаваемая платформой, флуоресценция не детектируется. Идущие подряд распознаваемые платформой аминокислоты определяются одна за другой.

Кинетика связывания всех белков с пептидом зависит не только от N-концевой аминокислоты, но и от следующих аминокислот, хоть и в меньшей степени. Например, сигналы от лейцина, после которого находится метионин, и от лейцина, после которого находится сульфоксид метионина, различаются. Это демонстрирует принципиальную возможность использования платформы для определения пост-трансляционных модификаций.

Авторы определили последовательности двух синтетических пептидов в составе одной смеси. Далее, чтобы продемонстрировать, что систему можно использовать для анализа биологических образцов, исследователи проанализировали смеси пептидов, полученных при расщеплении пептидазами рекомбинантных убиквитина человека (76 аминокислот) и белка GLP-1 (37 аминокислот). При анализе были выявлены характерные для этих белков пептиды DQQRLIFAGK и EFIAWLVK.

В настоящий момент речь не идет о de novo секвенировании белков. Тем не менее, согласно расчетам авторов, семь аминокислот, доступных для секвенирования на настоящий момент, составляют 36,5% всего протеома человека, а характерные уникальные пептиды, составленные из этих аминокислот, представлены в 96,7% белков человека. Ведутся работы по улучшению платформы.

Источник

Reed B.D., et al. Real-time dynamic single-molecule protein sequencing on an integrated semiconductor device. // bioRxiv, posted 10 January 2022; DOI: 10.1101/2022.01.04.475002

Добавить в избранное

Вам будет интересно