100 000 геномов и геном вашего пациента. NGS в медицинской генетике

NGS — инструмент, который изменил реальность врача-генетика. Этими словами начала свой доклад Наталия Семенова, ведущий научный сотрудник научно-консультативного отдела, врач-генетик Медико-генетического научного центра (МГНЦ) им. Н.П. Бочкова.

С одной стороны, NGS-диагностика дает возможность нового взгляда на уже изученные заболевания. Иногда это приводит к тому, что изменяются или расширяются диагностические критерии, изменяются классификации. С другой стороны, в некоторых случаях только с помощью NGS удается установить диагноз. Пример из собственной практики Наталии Александровны — найденное у ребенка редкое генетическое заболевание, дефицит карбоангидразы VA. Это аутосомно-рецессивное заболевание с дебютом в неонатальном возрасте, потенциально курабельное и имеющее благоприятный прогноз при своевременной диагностике. Заболевание крайне редкое, согласно мировым популяционным данным, однако при анализе частоты носительства в российской популяции оказалось, что частота его в десятки раз выше. Всего в мире описано менее 20 пациентов с данным заболеванием.

В ряде случаев NGS позволяет оценить вклад моногенных заболеваний в патологию, которая ранее рассматривались как ненаследственная или многофакторная. Пример — острая печеночная недостаточность детского возраста, природа которой в 40% остается неясной. С помощью NGS показано, что в 37% случаев она имеет генетическую природу, и определены ассоциированные с ней гены; наибольший вклад вносят митохондриальные заболевания и заболевания, связанные с нарушением везикулярного транспорта.

NGS-диагностика незаменима для определения возможности назначения таргетной терапии наследственных заболеваний. Она позволяет проводить дифференциальную диагностику фенотипически схожих нозологических форм, диагностировать заболевания, обусловленные соматическим мозаицизмом, возникающие на ранних этапах эмбриогенеза. Вместе с тем к данным NGS следует относиться с осторожностью и вниманием, подчеркнула докладчица.

Доклад Оксаны Рыжковой, заведующей ЦКП «Геном» Медико-генетического научного центра имени академика Н.П. Бочкова, был посвящен актуальной проблеме — как лаборатория переживает трудные времена последних двух лет, удается ли продолжать исследования в условиях санкций. Для лаборатории МГНЦ от решения этой проблемы зависит возможность не прекращать молекулярно-генетическую диагностику, в которой нуждаются пациенты.

Прежде всего, проблемы с поставками осложнили этап выделения ДНК и создания геномных библиотек. Переход лаборатории на приборы китайского и корейского производства в большой степени решает эту проблему — эти приборы могут работать как на зарубежных, так и на отечественных реактивах. С расходным материалом, в том числе лабораторным пластиком, также были проблемы, как с поставками, так и с ценообразованием. Решились они благодаря отечественным, китайским, индийским и другим аналогам.

Более всего пострадали этапы работы, в которых задействована робототехника, поэтому некоторые автоматизированные процессы заменяли ручным трудом. Для этого приходится задействовать большое количество сотрудников, падает производительность и возрастает вероятность ошибок, отметила Оксана Рыжкова. Если речь идет о секвенировании генома или экзома, его не переделаешь, ошибка может быть фатальна. В скором времени стали появляться новые роботы, сначала такие, которые необходимо программировать самостоятельно, однако сейчас на рынок вышли новые роботы, включая те, что создают геномные библиотеки от начала до конца, и стоимость оборудования приемлемая. Приятным отличием от предыдущих является возможность их самостоятельного программирования, без дополнительной оплаты каждого протокола от инженера фирмы-поставщика роботизированной станции. Качество геномного секвенирования на MGI T7 и Illumina NovaSeq не сильно отличается, отметила докладчица. Сейчас специалисты ждут выхода на рынок китайских длинноридовых секвенаторов.

Хотя последние два года были очень стрессовыми, подвела итог Оксана Рыжкова, возникающие проблемы удается решить. Главное, что диагностика не остановилась и пациенты не пострадали.

Национальную генетическую инициативу  «100 000 + Я» на конференции представил Биомедицинский отдел ООО «Биотехнологический Кампус». Этот проект стартовал в 2022 году и ставит цель к 2025 году секвенировать 100 тысяч геномов жителей России. В задачи проекта входит поиск взаимосвязей между генетической информацией и фенотипом человека, а также совершенствование диагностики наследственных и онкологических заболеваний.

Проект реализуется на базе геномного центра ООО «Биотехнологический Кампус» при поддержке ПАО «Роснефть» в рамках технологического партнерства с Правительством РФ по федеральной Научно-технической программе развития генетических технологий.

В выборку для секвенирования входят две когорты. Семьдесят тысяч образцов составят так называемую популяционную часть инициативы — это волонтеры, которые представляют здоровое городское население из всех федеральных округов. Как сообщается на сайте проекта, их набирают среди сотрудников «Роснефти» и их родственников. Тридцать тысяч образцов возьмут у пациентов медицинских учреждений, страдающих тяжелыми наследственными заболеваниями; в эту же выборку войдут представители различных этносов, проживающих в России.

В геномной лаборатории в режиме 24/7 работают шесть высокопроизводительных секвенаторов китайской компании MGI. Их текущая производительность — до 1000 сиквенсов в неделю. Для пробоподготовки используются роботизированные станции. На сегодняшний день секвенировано уже около 33 тысяч полногеномных последовательностей, суммарный объем полученных данных составляет 15 петабайт информации. Для анализа данных используется компьютерный кластер, входящий в топ-50 суперкомпьютеров России, в коллективе ему дали имя «Тимофеев-Ресовский». Данные хранятся в защищенном внутреннем контуре.

В популяционной части проекта у 1% участников обнаружены генетические варианты из списка «вторичных находок» Американского колледжа медицинской генетики и геномики (ACMG), в том числе клинически значимые. (Вторичные находки, или побочно выявленные варианты — патогенные или вероятно патогенные генетические варианты, ассоциированные с заболеванием, отличным от направительного диагноза.) Информировать о таких находках возможно только тех участников, которые дали согласие на получение такой информации.

Что касается клинической части проекта, то в центр поступают образцы из 13 партнерских медицинских организаций. Совместно с Центром детской гематологии и иммунологии имени Димы Рогачева по секвенировании 2500 образцов пациентов удалось найти генетические предикторы онкологических и гематологических заболеваний и подобрать таргетную терапию. Ученые поставили задачу каждому пациенту выдать фармакогенетический отчет, который позволит врачу выбрать терапию для конкретного больного, скорректировать дозу. Планируется также изучение новых значимых для терапии генетических вариантов, не описанных в разных этнических популяциях.

Среди пациентов клинической больницы №52 г. Москвы секвенировано и проанализировано более 500 образцов пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями и нарушениями иммунитета, и описано 16 ранее не известных связанных с ними генетических вариантов.

Секвенировано более 3000 образцов пациентов МГНЦ с наследственными орфанными заболеваниями, в некоторых случаях это помогло установить точный диагноз или скорректировать тактику лечения. В некоторых случаях генетики проводят секвенирование в формате трио (мать-отец-ребенок).

Сейчас активно прорабатываются механизмы, которые позволят обеспечить доступ к ресурсам проекта для научного сообщества. Один из способов — включение ресурсов кампуса в реестр уникальных научных установок.

Популяционная выборка участников проекта формируется из сотрудников «Роснефти» и их родственников, при этом в нее входят не только офисные работники — сбор материала проводился и на производственных площадках в разных регионах. Кроме того, к партнерству привлекались этнические геномные коллекции, собранные научными коллективами, чтобы получить референсные геномы отдельных этнических групп.

Доклад Игоря Бычкова, старшего научного сотрудника лаборатории наследственных болезней обмена веществ МГНЦ им. Н.П. Бочкова, был посвящен стремительно развивающемуся направлению персонифицированной медицины — антисмысловой терапии.

Идее использовать антисмысловые молекулы (преимущественно РНК- и ДНК-олигонуклеотиды, комплементарные целевому участку) в качестве инструмента генетической терапии насчитывается более 45 лет, и большинство одобренных генетических препаратов — это именно антисмысловые олигонуклеотиды.

В 2016 году пациенту был поставлен диагноз «болезнь Баттена», но был найден лишь один патогенный генетический вариант в гене, отвечающем за развитие данной болезни. Дальнейшие события перевернули взгляды всего мира на антисмысловые молекулы.

Болезнь Баттена развивается при наличии двух патогенных вариантов в гене, располагающихся на разных хромосомах, поэтому пациенту было проведено полногеномное секвенирование. В результате на второй хромосоме была обнаружена инсерция мобильного генетического элемента, приводящая к нарушению сплайсинга и преждевременной терминации транскрипции.

Далее ученые протестировали различные антисмысловые молекулы и нашли наиболее эффективную, которая приводила к восстановлению экспрессии гена. На основе этой последовательности был синтезирован препарат миласен (Milasen). Препарат оказал положительный эффект на состояние пациента и значительно замедлил стремительный прогресс заболевания. От начала научного исследования по поиску второго патогенного варианта до одобрения препарата прошло менее года, поэтому данный случай по праву считается началом эры персонифицированной антисмысловой терапии. Она предназначена для лечения пациентов с ультраредкими заболеваниями (1–30 пациентов в мире), а для поддержки ее разработки в мире создано несколько фондов.

Антисмысловые молекулы — это преимущественно химически модифицированные РНК. Модификации нужны, чтобы препятствовать деградации РНК и усиливать ее способность проникать в клетку. Тестирование антисмысловых молекул проводят на модельных клеточных системах или на культурах клеток пациента. Об эффективности молекул судят по восстановлению нормального сплайсинга или экспрессии гена, а также по функциональной активности его продукта.

Стоит отметить, что самые известные препараты на основе антисмысловых РНК, применяемые для лечения миодистрофии Дюшена и спинальной мышечной атрофии, как раз опосредуют свой эффект через модуляцию сплайсинга генов DMD и SMN2 соответственно. Механизм действия этеплирсена заключается в стимуляции пропуска экзона 51 гена DMD, содержащего у пациентов преждевременный стоп-кодон, что позволяет транслироваться укороченному, но частично функциональному белку. Механизм действия препарата нусинерсена, заключается, наоборот, в стимуляции включения в зрелую мРНК экзона 8 гена SMN2, который является слабо активной копией гена SMN1, ассоциированного со спинальной мышечной атрофией. Включение в зрелую мРНК экзона 8 гена SMN2 приводит к увеличению экспрессии полноразмерного транскрипта и увеличению количества функционального белка, что компенсирует недостаточность гена SMN1.

«Давайте посмотрим, насколько сложно пройти этот путь от постановки молекулярно-генетического диагноза до создания персонифицированного препарата», — предложил Игорь Бычков. Он привел несколько случаев из своей практики в МГНЦ, когда удавалось не только установить молекулярно-генетический диагноз и охарактеризовать нарушение функции гена вследствие выявленных мутаций, но и сделать следующий шаг, приближающий к созданию персонифицированного антисмыслового препарата.

Первый пример — пациент с мукополисахаридозом 4Б типа, у которого найден лишь один патогенный генетический вариант, но при полногеномном секвенировании обнаружена инсерция редкого мобильного генетического элемента — процессированного псевдогена. Было показано, что данная инсерция нарушает сплайсинг гена и приводит к инсерции псевдоэкзона в зрелую мРНК. Использовав для тестирования антисмысловых молекул модельную клеточную систему, исследователи успешно восстановили нарушенный сплайсинг.

У другого пациента с мукополисахаридозом 6 типа при секвенировании по Сэнгеру ответственного за заболевание гена, не было обнаружено патогенных вариантов. При анализе РНК исследователи нашли инсерцию псевдоэкзона и также нацелили на нее антисмысловые молекулы. В теле псевдоэкзона был обнаружен участок, блокировка которого восстановила сплайсинг.

В фибробластах еще одного пациента с дефицитом лизосомальной кислой липазы, вызванным частым патогенным вариантом, с помощью антисмысловых молекул удалось усилить распознавание экзона, который был нарушен мутацией сплайсинга.

Все эти исследования специалисты МГНЦ пока проводят на культурах клеток, но, как сказал Игорь Бычков, работа продолжается, и специалисты надеются через какое-то время перейти к доклиническим испытаниям на модельных животных.