Флуоресцентный краситель защитит от яда бледной поганки

Более 90 % случаев летальных исходов при отравлении грибами происходят из-за бледной поганки. В состав ее яда входит α-аманитин, который и представляет основную опасность. Токсическое воздействие α-аманитина на организм человека объясняется ингибированием РНК-полимеразы II, однако точный механизм пока не установлен. Это затрудняет разработку специфичных антидотов, которые направленно блокировали бы эффект токсина. Авторы новой публикации в Nature Communications предложили кандидата на эту роль. Им оказался индоцианиновый зеленый — краситель, применяемый в медицинской диагностике с 1956 года.

Первым этапом исследования стало выявление ключевых регуляторов и сигнальных путей, опосредующих индуцированную α-аманитином клеточную гибель. Исследователи провели полногеномный нокаутный скрининг с применением CRISPR на гаплоидной клеточной линии человека HAP1, которая часто используется для изучения механизмов лекарственной устойчивости и различных токсических эффектов.

Клетки с теми или иными нокаутными генами обрабатывали α-аманитином в течение 7 дней, а затем секвенировали геном выживших клеток. Дальнейший анализ выявил ряд генов, ассоциированных с клеточной гибелью под действием α-аманитина. Как и ожидалось, сильнее всего были затронуты процессы, связанные с активностью РНК-полимеразы II. Кроме того, было выявлено два метаболических пути, связь которых с токсичностью α-аманитина ранее не была показана. Это биосинтез N-гликанов и метаболизм холестерина. В первую очередь исследователи сосредоточились на синтезе N-гликанов, на центральные компоненты которого (STT3B и MGAT1) указал проведенный анализ метаболических путей. STT3B — один из ключевых компонентов пути синтеза N-гликанов. Вместе с STT3A он формирует в ЭПР олигосахарилтрансферазный комплекс, участвующий в посттрансляционном гликозилировании. Нокаут STT3B при помощи CRISPR-Cas9 повысил устойчивость клеточных линий HAP1 и HepG2 к α-аманитину. Аналогичный эффект был получен на HepG2 путем нокдауна STT3B при помощи малых образующих шпильки РНК (shRNA). Дальнейшие опыты показали, что нокаут STT3B снижал проникновение токсина в эти клетки, хотя и не влиял при этом на экспрессию транспортеров α-аманитина (OATP1B3 и NTCP).

Ингибирование гликозилирования за счет блокировки STT3B способно приводить к стрессовому ответу ЭПР или аппарата Гольджи, однако на модельных клеточных линиях стрессовой реакции обнаружено не было. На основе полученных данных авторы предположили, что достаточно эффективным и вместе с тем безопасным антидотом к токсину бледной поганки может стать ингибитор активности STT3B.

Искать подходящий препарат ученые стали при помощи in silico скрининга. Путем компьютерного моделирования они проанализировали 3201 одобренное FDA лекарство. Поиск выявил 34 соединения, ингибирующую активность которых авторы работы стали исследовать на клеточной модели. Эффективно препятствовали токсическому эффекту α-аманитина два препарата: индоцианиновый зеленый (ICG) и позаконазол, причем первый из них показал близкую к 100 % защиту клеток от гибели.

Данные молекулярного докинга указывают на то, что ICG селективно занимает субстрат-связывающий участок STT3B, что, по всей видимости, объясняет его ингибиторный эффект. Молекула взаимодействует с активным центром STT3B, причем сульфобутильные группы образуют водородные связи с тремя аминокислотными остатками в белке (Ser319, Trp380 и Ser449).

Сам препарат — это флуоресцентный краситель, который применяется для ангиографии глаз и оценки функционирования печени. Его терапевтический эффект в качестве антидота к α-аманитину изучили сначала на клеточной, а затем на животной модели. Внутриклеточную локализацию вещества детектировали по его собственной флуоресценции, и оказалось, что он преимущественно накапливается в ЭПР. Дальнейший анализ с применением репортерной люциферазы показал, что ICG успешно ингибирует N-гликозилирование, которое протекает в ЭПР при участии STT3B.

Опыты на мышиной модели показали: введение изучаемого препарата мышам, получавшим дозу α-аманитина, значительно снижало воздействие токсина на организм. В первую очередь при отравлении α-аманитином страдают печень и почки. Их состояние у модельных животных оценивали при помощи анализа биохимических маркеров крови (АСТ, АЛТ и щелочная фосфатаза для оценки состояния печени, азот мочевины и креатинин — для почек) и гистологических исследований. Биохимический анализ крови указывал на то, что сам по себе α-аманитин приводил к серьезным повреждениям печени и почек. Этот эффект, однако, значимо снижался у тех мышей, которым вводили индоцианиновый зеленый. Гистологические исследования также подтвердили эффективность ICG — так, этот препарат препятствовал некрозу печени, вызванному α-аманитином. Оценка долгосрочной выживаемости мышей, отравленных токсином бледной поганки, показала, что ICG улучшает прогноз на 30-дневном сроке и при этом не вызывает явных побочных эффектов. К концу этого срока выжило 50 % мышей, получавших индоцианиновый зеленый после отравления α-аманитином, тогда как без антидота выжила только одна из шести мышей.

Исследователи также оценили временной интервал, в который следует давать антидот при отравлении. Терапевтическое воздействие ICG было достаточным при введении через 1–4 часа и снижалось, когда его давали через 8–12 часов после поступления α-аманитина в организм. Из этого следует, что данный антидот в случаях отравления α-аманитином следует применять как можно скорее, чтобы избежать необратимых токсических эффектов.

Изучение птиц и лягушек поможет в поисках антидота к батрахотоксину и сакситоксину