Геном малярийного плазмодия картировали с помощью транспозонного мутагенеза

Картирован геном Plasmodium knowlesi — вида плазмодия, заражающего нечеловекообразных приматов и близкого к P. vivax. Скрининг, проведенный с помощью мутагенеза, выявил гены, важные для жизнедеятельности паразита. Некоторые из этих генов могут стать мишенями для новых лекарственных препаратов.

Паразиты рода Plasmodium вызывают около 249 миллионов случаев малярии каждый год и приводят к более 600 тысячам смертей. Усилия по снижению ущерба от заболевания в последние годы недостаточно эффективны, даже несмотря на то, что появились вакцины против P. falciparum — возбудителя тропической малярии, самой опасной ее формы. Лечение осложняется устойчивостью паразитов к противомалярийным препаратам. Более того, в Юго-Восточной Азии растет число зоонозных случаев малярии, вызванных видами P. knowlesi и P. cynomolgi, которые в природе заражают макак-крабоедов.

Эволюционно P. falciparum вместе с подродом Laverania spp. отличаются от большинства плазмодиев, которые заражают приматов. Виды P. knowlesi и P. cynomolgi находятся в одной ветви с P. vivax, который вызывает у человека менее тяжелую болезнь, чем P. falciparum, но более широко распространен. Виды плазмодия, инфицирующие нечеловекообразных приматов, — ценные модели, поскольку P. vivax не может быть выращен in vitro.

Ученые из США, Бразилии и Португалии провели картирование генома P. knowlesi, используя высокоэффективный мутагенез с транспозазой piggyBac. Им удалось создать большую библиотеку мутантов и определить гены, важные или несущественные для жизнеспособности и воспроизведения паразита на стадиях жизненного цикла, которые протекают в эритроцитах.

«Появление лекарственной устойчивости к немногочисленным противомалярийным препаратам становится все более серьезной проблемой. Эта карта станет ценным ресурсом, который поможет исследователям бороться с одной из основных причин смерти от инфекционных заболеваний во всем мире», — объясняет значение полученных результатов последний автор статьи Манодж Дурайсинг (Гарвардская школа общественного здравоохранения Т. Х. Чана, Бостон, Массачусетс, США).

Исследователи использовали штамм P. knowlesi YH1, который культивировали в эритроцитах макак-резусов. Эти клетки более физиологичны для жизнедеятельности паразита, чем эритроциты человека. Для проведения мутагенеза ученые использовали две плазмиды. Одна из них содержала ген гиперактивной версии транспозазы piggyBac. Вторая содержала транспозон и ген селективного маркера hDHFR (дигидрофолатредуктаза человека), чтобы можно было отличить мутантные клоны. Паразиты, успешно получившие новую вставку, могли выжить в среде с добавлением гипоксантина и ингибитора DHFR, а другие погибали. Ученые вводили обе плазмиды одновременно в зрелые шизонты, используя электропорацию. Места интеграции транспозонов в геноме паразита определяли с помощью количественного секвенирования сайтов вставки (QIseq).

Специалистам удалось получить 1 456 750 транспозонных вставок — примерно в 38 раз больше, чем было достигнуто ранее в аналогичном скрининге P. falciparum. Для оценки данных они разработали математическую модель и ввели параметр HMS (hybrid model score), чтобы классифицировать гены по степени их важности для жизнедеятельности паразита. Чем больше мутаций обнаружено в участке генома, тем меньше вероятность того, что этот участок содержит важные гены.

В общей сложности 2037 генов (38,68%) были классифицированы как существенные, 2124 (40,34%) как — несущественные и 1105 (20,98%) — как неопределенные, с промежуточными значениями HMS. Количество важных генов согласовалось с предыдущими исследованиями видов, принадлежащих к типу Споровики (Апикомплексы), все представители которого являются паразитами. У них доля существенных генов выше, чем у свободноживущих организмов, так как паразит обеспечивает себя «несущественными» преимуществами за счет метаболизма хозяина.

Гены, участвующие во взаимодействии хозяина и паразита, в большинстве случаев оказались несущественными in vitro. Например, в эту группу попали общие для P. knowlesi и ветви P. vivax гены SICAvar, кодирующие белки, которые экспрессируются на поверхности зараженных эритроцитов. Они высоковариабельны, что позволяет плазмодию быстро менять антигенные свойства и уклоняться от иммунитета. К несущественным для P. knowlesi, растущему в культуре, также относились гены PPPK-DHPS и FPP/GGPPS, которые рассматривались как приоритетные мишени для лекарственных средств.

Среди 10 генов, важных для жизнедеятельности P. knowlesi, два были связаны с циклом трикарбоновых кислот: орнитинаминотрансфераза (OAT) и глутаматдегидрогеназа 3 (GDH3). Ученые протестировали зависимость паразитов от функции OAT с помощью ингибитора этого фермента — L-каналина. Он был активен против P. knowlesi, но не против P. falciparum или P. vivax. Далее с помощью фторацетата натрия исследователи ингибировали ключевой шаг ЦТК, катализируемый аконитазой. Это подействовало на P. knowlesi и P. vivax, но не на P. falciparum. Таким образом, P. knowles более зависим от энергетического метаболизма, чем другие виды.

Ученые также исследовали гены, связанные с чувствительностью P. knowlesi к противомалярийным препаратам. Воздействие производного артемизинина (ДГА) выявило 10 таких генов (частота вставок в них существенно изменялась при выращивании в присутствии ДГА). Два из них, НАДН-убихинон-оксидоредуктаза типа II (NDH2) и рибофлавинкиназа (RFK), имеют функции, связанные с митохондриальным метаболизмом. Примечательно, что NDH2 повышается и в мутантах P. falciparum, устойчивых к ДГА. Исследователи обнаружили несколько генов, для которых ранее не была показана связь с чувствительностью к артемизинину, например, ген транспортного белка SEC16.

Данные о значимости генов P. knowlesi для выживания паразита могут стать полезным инструментом как при разработке противомалярийных препаратов и вакцин, так и в сравнительных исследованиях паразитических видов типа Споровики.

Результаты скрининга генома P. knowlesi с помощью транспозонного мутагенеза, проведенного еще одной исследовательской группой, представлены также в другой статье, опубликованной в Science на прошлой неделе.

Резистентных к артемизинину возбудителей малярии выявили у детей с тяжелой формой заболевания