МД-2021, день 3. Инфекционные и наследственные болезни животных

Секция «Технологии выявления инфекционных и наследственных болезней животных» прошла 11 ноября в рамках X конференции «Молекулярная диагностика 2021». Специалисты обсудили проблему борьбы с репродуктивно-респираторным синдромом свиней, использование генотипирования для оценки племенной ценности, занос африканской чумы свиней в Россию, качество ветеринарных ПЦР-тестов, перспективы вакцин на основе рекомбинантных белков и другие темы.

Credit:

worawutsaewong | 123rf.com

Первый доклад «Репродуктивно-респираторный синдром свиней: особенности диагностики и профилактики» представил Алексей Забережный (ФНЦ ВИЭВ РАН). Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) — это инфекция, вызываемая РНК-содержащим вирусом семейства Arteriviridae. Впервые болезнь была обнаружена в 1986 году сразу в двух частях света, в Европе и в Америке. По первичной структуре РНК американский и европейский вирус мало похожи, но вызывают один и тот же синдром. Европейский и американский генотипы обозначаются индексами 1 и 2 соответственно. РРСС известен также как болезнь синего уха.

Вирус РРСС поражает альвеолярные макрофаги. Болезнь очень опасна для молодых свиней, так как в их легких содержится огромное количество альвеолярных макрофагов. Заражение беременной свиньи приводит к поражению плода. Вирус крайне контагиозен; если он выявлен у одного животного, все поголовье считается неблагополучным.

На первых этапах изучения вируса его культивировали в первичных альвеолярных макрофагах поросят. Создание системы культивирования в клетках линии MA104 избавило поросят от инвазивной процедуры получения макрофагов.

В России разработаны моноклональное антитело к вирусу РРСС и методы иммуногистохимического анализа. Для диагностики инфекции используются иммуноферментный анализ, нацеленный на белок нуклеокапсида, и ПЦР-тесты. Вируснейтрализующие антитела появляются в крови свиней на 45-й день после заражения.

Забережный рассказал об истории выделения и секвенирования вируса РРСС. Синтез вируса в лаборатории группой Т.В. Гребенниковой дал возможность получить аттенуированный вариант для разработки вакцины. Сейчас вакцины против РРСС существуют, но их эффективность сомнительна. По-прежнему распространен метод акклиматизации ремонтного стада к местному штамму вируса.

Докладчик также привел данные о механизме инфицирования. Вирус заражает макрофаги, что отражается на их численности, но с течением времени уровень макрофагов нормализуется. Ученые объясняют это явление рецепторной специфичностью вируса. Он связывается с макрофагами из преобладающей популяции и уничтожает их. На их место приходят макрофаги минорной популяции, несущие другие рецепторы, а потому нечувствительные к вирусу. С другой стороны, изменение рецепторной специфичности может сделать вирус более опасным. Забережный привел в пример самый «злой» штамм вируса РРСС Lena, который относится к генотипу 1 и циркулирует в Белоруссии.

Докладчик отметил, что вирус РРСС похож по структуре на SARS-CoV-2, только его геном значительно меньше. Это вызывает опасения, не поменяет ли рецепторную специфичность и SARS-CoV-2.

РРСС пока не побежден. Один из способов борьбы с ним — создание генетически модифицированных свиней. Было показано, что свиньи, лишенные рецептора CD163, полностью устойчивы к заболеванию.

Мария Брюсова (ВГНКИ) выступила с докладом «Изучение параметров качества диагностических ПЦР-наборов для ветеринарного применения». В России нет процедуры регистрации ветеринарных диагностических наборов и стандартизованных требований к ним. Группа Брюсовой сравнила ветеринарные ПЦР-наборы на африканскую чуму свиней (АЧС) и грипп А. На первом этапе оценивались внешний вид, комплектация, эргономичность наборов и качество изложения инструкции. Затем проверялись стабильность компонентов в различных условиях, в том числе после замораживания и оттаивания, сравнивались чувствительность и специфичность на различном биоматериале и панелях изолятов вирусов из коллекций.

Ученые рассмотрели 12 наборов для выявления вируса гриппа А семи отечественных производителей. Наборы шести из семи производителей получили замечания к инструкции и маркировке. У реагентов четырех из семи производителей были проблемы со стабильностью. Специфичность подтвердилась для наборов четырех производителей. Чувствительность наборов для одного биоматериала различалась на пять порядков. Один набор был исключен из исследования как неработоспособный.

Большинство из 12 наборов для выявления АЧС десяти отечественных производителей получили замечания к инструкциям, внешнему виду и эргономике. Все наборы кроме одного продемонстрировали 100-процентную специфичность. Чувствительность была приемлемой, но различалась для одного биоматериала на два-три порядка. Наборы пяти производителей получили замечания по стабильности реагентов.

Брюсова отмечает, что варьирование чувствительность одного набора в столь широких пределах говорит о недостаточном контроле производства и необходимости внедрения государственных стандартов.

Следующий спикер Юрий Пеков (Ksitest) представил доклад «Генетические тесты для улучшения продуктивности и здоровья коров». Традиционно фермеры предсказывают, какая корова будет давать, например, большие удои, по ее матери. Этот подход до последнего времени сохранялся и в России. За рубежом же возникла идея геномной оценки, известная как BLUP (best linear unbiased predictor). Фактический удой зависит от генетических факторов (племенной ценности), года и сезона, номера отела матери, возраста лактации и условия содержания. Вклад каждого фактора известен. Оценить генетический фактор можно генотипированием. Оценка именно геномной племенной ценности получила название gBLUP.

В настоящее время на западе существуют референтные базы данных. Фермер отдает на анализ образец от своей коровы и получает информацию о ее племенной ценности. При этом каждая база учитывает и условия содержания коров, а они сильно различаются в разных странах, поэтому оценка племенной ценности российской коровы по зарубежной базе будет недостоверной. Компания Ksitest собрала такую базу для крупного рогатого скота в России. Это самая большая база в стране, она включает данные о 330 000 животных с известными фенотипами. Ksitest предоставляет услуги по геномной селекции, включающие забор образца, генотипирование и оценку племенной ценности. Оценка проводится по молочной продуктивности, продуктивному долголетию, межотельному интервалу и т.д. и выставляется отдельно для каждого признака. По словам Пекова, средняя достоверность оценок составляет 72%.

Пеков отметил, что можно проанализировать также так называемые гаплотипы голштинского скота, связанные с заболеваниями, и сыропригодность сырого молока по генам CSN3 и CSN2.

По словам Пекова, в настоящее время Ksitest также собирает базу по овцам.

После Юрия Пекова выступил Олег Верховский (НИИ ДПБ) с докладом «Технология рекомбинантных белков — инновационная составляющая производства ветеринарных вакцин». Верховский рассказал о технологии создания ветеринарных вакцин на основе вирусоподобных частиц, несущих рекомбинантные вирусные белки. Такие частицы производятся в бакуловирусной экспрессионной системе.

В настоящее время в России уже используются такие вакцины, например, против цирковирусной болезни свиней. Препарат создан на основе рекомбинантного белка ORF2 штамма PCV2a. Верховский отметил, что расслабляться рано, так как генетическая вариабельность коснулась и этого вируса и в России появляются разные генотипы. По его мнению, можно заменять антиген в вакцине на более актуальный и создавать вакцины, специфичные для каждого региона.

Докладчик рассказал о вакцине против РРСС, содержащей инактивированный вирус и дополнительно рекомбинантные белки ORF-5 и ORF-6, и о разработке препарата против классической чумы свиней (КЧС). К настоящему времени в бакуловирусной системе получен рекомбинантный белок E2 вируса КЧС.

Верховский считает, что вакцины на основе рекомбинантных белков абсолютно безопасны. Он отметил, что для эффективной работы таких вакцин необходим адъювант.

Елена Барышникова (НекстБио) представила доклад «Возможности генетической дифференцировки вирусов геморрагической болезни кроликов 1 и 2 типа». В настоящее время лидером кролиководства является Китай. В России эта отрасль растет. Вирусы геморрагической болезни кроликов (ВГБК) — одна из проблем отрасли. Летальность инфекции достигает 80–100%.

Первая вспышка ГБК произошла в Китае в 1984 году. К 1990-м гг. болезнь детектировалась в 40 странах мира. Первая вспышка инфекции ВГБК на территории Российской Федерации зарегистрирована в 1986 г. на границе с Китаем. Зараженные шкурки попали в Москву, откуда вирус распространился в 31 регион страны. ВГБК 2 типа циркулирует в России с 2017 г.

ВГБК и ВГБК 2 типа отличаются спектром хозяев и клиническими проявлениями. Так, ВГБК заражает всех европейских кроликов. К ВГБК 2 типа восприимчивы не только кролики, но и зайцы. Для ВГБК характерно молниеносное сверхострое течение инфекции; течение болезни при ВГБК 2 типа может быть подострым и хроническим. Вирус передается при прямом контакте, а также через подстилку, воду и корм. Возможен и механический перенос мухами и другими насекомами. Патоген хорошо переносит замораживание, поэтому возможен его импорт с инфицированным мясом. Основное средство профилактики — вакцинация. Для диагностики достаточно выявления антител к возбудителю, его антигена или нуклеиновых кислот.

Барышникова рассказала о создании теста для генетической дифференциации ВГБК и ВГБК 2 типа на основе ПЦР в реальном времени. Валидацию теста проводили на биоматериале от инфицированных животных. При анализе специфичности использовали также вирус-отрицательные образцы. Кроме этого, определили повторяемость и воспроизводимость результатов.

Тест выявил все 16 образцов, содержащих ВГБК или ВГБК 2 типа, и дал отрицательный результат для всех 13 образцов, не содержащих вирус. Коэффициенты вариации внутрилабораторной прецизионности в условиях повторяемости и воспроизводимости составили 1,7–3% и 1,6–2%, соответственно.

После Барышниковой выступил Алексей Даниленко (ГНЦ ВБ «Вектор») с докладом «Биологическое разнообразие коронавирусов в популяциях диких и домашних птиц, исследованное с использованием метода NGS в России в 2020–2021 гг.».

В птицах в основном детектируются гамма- и дельтакоронавирусы. В частности, к гаммакоронавирусам относится вирус инфекционного бронхита кур (IBV), высоколетальный для цыплят. Он распространен везде, где есть птицеводство. Птичьи коронавирусы разносятся перелетными птицами. Несмотря на то, что коронавирусы склонны менять хозяев, случаев передачи коронавирусов от птиц к человеку не зарегистрировано.

Даниленко рассказал об исследовании на коронавирусы образцов от диких и домашних птиц России, проведенной специалистами центра «Вектор». Проанализировали 561 образец от диких и домашних птиц; секвенировали геномы вирусов из 37 инфицированных образцов. Зараженность птиц составила 12,8%. В образцах от диких птиц в 69% случаев выявили гаммакоронавирусы, меньшая доля приходилась на дельтакоронавирусы. Также обнаружены образцы с одновременным присутствием гамма- и дельтакоронавирусов. В образцах от домашних птиц содержались только гаммакоронавирусы.

Филогенетический анализ показал, что гаммакоронавирусы попадают в ту же кладу, что и доминирующий в России штамм IBV 4/91. На основе этого штамма изготовлена живая вакцина против инфекционного бронхита кур. В обсуждении после доклада было отмечено, что обнаруженные гаммакоронавирусы могут быть вакцинного происхождения.

Циркуляция дельтакоронавируса среди диких птиц в России была показана впервые. Выявленные вирусы распределяются в две новые клады, ближайшим к ним референсным штаммом является White-eye coronavirus HKU16.

Следующий спикер Диана Дроботова (Thermo Fisher Scientific) представила доклад «Новые возможности микрочипов и NGS в программах селекции животных». К 2026 году ожидается рост использования маркерной селекции и микрочипов. Один из методов геномной селекции — генотипирование по SNP и поиск новых SNP в GWAS. Компания Thermo Fisher Scientific начала изготовление микрочипов в 1980-х гг., но в России технология генотипирования на микрочипах осваивается только сейчас.

Генотипирование в животноводстве может использоваться для определения индекса племенной ценности, выявления хозяйственно-полезных признаков и определения генетических заболеваний. Thermo Fisher Scientific предлагает решение Axiom, позволяющее выявлять до сотен тысяч генетических маркеров в одном образце с помощью гибиридизации. (Подробнее об Axiom Диана Дроботова рассказала на сателлитном симпозиуме компании.) Докладчица отметила, что компания Thermo Fisher Scientific обладает самым большим каталогом микрочипов для агрогеномики, а также предоставляет возможность кастомизации.

Другой вариант генотипирования — таргетное NGS. Оно используется для рутинного скрининга, диагностики болезней, определения признаков, аномалий и родства. В портфолио Thermo Fisher Scientific есть соответствующее решение для сельского хозяйства — AgriSeq. Технология использует полупроводниковое секвенирование. Один чип для таргетного NGS может содержать от 100 до 500 маркеров. Чипы AgriSeq анализируются на платформах Ion GeneStudio. Как и в случае с Axiom, возможна кастомизация чипа.

Константин Алексеев (ООО «Ветбиохим») представил доклад «Хроническая изнуряющая болезнь диких копытных (ХИБ) — потенциальная угроза биобезопасности страны». ХИБ относится к трансмиссивным губчатым энцефалопатиям. Она летальна в 100% случаев. ХИБ детектируется в Северной Америке, Южной Корее и странах Скандинавии.

Диагностика ХИБ основана на устойчивости патогенного белка PrPSc к протеиназе К. После обработки образца протеиназой можно применять иммуногистохимический анализ, ИФА или иммуноблоттинг. Диагностировать ХИБ необходимо, так как животное-носитель становится заразным до клинических проявлений. В первой половине 1990-х гг. ХИБ считалась безопасной для человека, однако после подтверждения передачи губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота человеку отношение к ХИБ было пересмотрено. В настоящее время считается, что американский штамм возбудителя ХИБ неопасен для людей. Европейский штамм возник позже и, по мнению докладчика, необходима всесторонняя оценка его зоонозного потенциала.

Алексеев считает, что риски ХИБ для России велики. ХИБ поражает лосей и оленей, а их популяция в стране довольно велика. В сентябре 2020 года животные, погибшие от ХИБ, были обнаружены в Финляндии, недалеко от границы с Россией, при этом есть свидетельства массового перехода лосей и оленей через границу. Еще один фактор риска — импорт оленей в частные охотхозяйства.

После Алексеева выступил Николай Зиняков (ФГБУ «ВНИИЗЖ») с докладом «Генетический анализ вирусов гриппа птиц, выявленных в РФ в 2018–2021 гг.». Во многих странах проводится профилактика гриппа птиц, но вирус не сдается и формируются новые антигенные подтипы. Зиняков представил результаты филогенетического анализа подтипов вируса, полученные референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ». Он отметил, что из-за пандемии геномные базы пополняются с задержкой и в настоящее время наблюдается дефицит свежих геномов вируса птичьего гриппа, полученных в Китае.

Зиняков привел данные по подтипу H9N2, который попал в Россию недавно, предположительно, из Китая. Последовательность этого подтипа схожа с таковой у H7N9, опасного для человека. H9N2 группы G1 был выявлен на челябинской птицефабрике, но сейчас невозможно установить, как он туда попал.

Докладчик отметил, что пандемический риск H9N2 выше, чем у H5N8.

Следующий спикер Евгения Овчинникова (ФГБУ «ВНИИЗЖ») представила доклад «Гетерогенность популяции вируса инфекционного бронхита кур». Она отметила высокую вариабельность вируса и то обстоятельство, что источником инфекции могут быть вакцинные штаммы. В 50% проб, положительных на вирус ИБК, содержится именно вакцинный вирус.

В хозяйстве могут одновременно циркулировать несколько полевых генотипов вируса. Определение конкретного генотипа затруднено тем, что на анализ присылают, как правило, коллективные образцы. Овчинникова представила данные по Саратовской птицефабрике, где куры стали хуже нестись. В этом случае для анализа были доступны индивидуальные образцы. Куры были вакцинированы тремя штаммами вируса, при этом изоляты были генетически гетерогенны. По мнению докладчицы, это может говорить о стремлении вируса приспособиться.

Завершил секцию доклад Андрея Шотина (ФГБУ «ВНИИЗЖ») «Сравнительный анализ полногеномной последовательности изолятов вируса АЧС, выделенных на территории России». Африканская чума свиней (АЧС) — высоколетальная вирусная инфекция, поражающая домашних свиней и диких кабанов. В настоящее время не существует средств профилактики АЧС, поэтому важны диагностика и контроль ее распространения.

Распространение АЧС в России началось в 2007 году. Ведутся дискуссии о том, откуда АЧС была занесена в Калининградскую область в 2017 г. и во Владивосток в 2019 г. Шотин представил анализ геномов 26 изолятов вируса АЧС, полученных от погибших диких кабанов, в сравнении с сиквенсами из базы GenBank. Так, изоляты из центральной части России были близки друг к другу и к изолятам из Грузии, изоляты из Приморского края кластеризовались с изолятами из Чехии, Бельгии и Китая. Все изоляты относились к генотипу II.

Шотин обсудил высокую стоимость полногеномного секвенирования и необходимость идентификации изолята по маркерам, например, по последовательности интергенного региона (IGR).

По мнению Шотина, российские вспышки АЧС 2017 и 2019 гг. произошли позже, чем вспышки в соседствующих странах, что косвенно подтверждает занос вируса из Польши в Калининградскую область и из Китая во Владивосток. Однако в дискуссии, состоявшейся после доклада, прозвучало иное мнение: польские и китайские ученые говорят ровно обратное и указывают на Россию как на источник заражения. АЧС может использоваться как политический инструмент: страна, которая первой признается во вспышке инфекции на своей территории, вылетит с животноводческого рынка.

Информация о докладчиках

Алексей Дмитриевич Забережный, д. б. н., профессор ФГБНУ «Федеральный научный центр — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук», Москва.

Мария Борисовна Брюсова, к. б. н., зав. отделом исследований биологических объектов ФГБНУ «ВГНКИ», Москва.

Юрий Алексеевич Пеков, компания Ksitest, Москва.

Олег Анатольевич Верховский, д. б. н., профессор, президент АНО «НИИ диагностики и профилактики болезней человека и животных» («НИИ ДПБ»), Москва.

Елена Ивановна Барышникова, компания «НекстБио», Москва.

Алексей Валерьевич Даниленко, к. б. н., ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирск.

Диана Юрьевна Дроботова, к. б. н., старший технический специалист компании Thermo Fisher Scientific.

Константин Петрович Алексеев, к. б. н., ООО «Ветбиохим», Москва.

Николай Геннадьевич Зиняков, к. б. н., ФГБУ «ВНИИЗЖ», Владимир.

Евгения Валерьевна Овчинникова, к. б. н., ФГБУ «ВНИИЗЖ», Владимир.

Андрей Романович Шотин, ФГБУ «ВНИИЗЖ», Владимир.

Добавить в избранное

Вам будет интересно