«Обратная геномика» позволяет вырастить ранее некультивируемые бактерии в пробирке

Исследователи разработали технологию «обратной геномики», позволяющую пройти путь от прочтения ДНК индивидуальной бактерии до выделения и культивирования микроорганизма, процент которого в бактериальном сообществе незначителен, а культивирование в отсутствие других членов этого сообщества — невозможно.

Credit:

Khamkhlai Thanet | Shutterstock.com

Большинство окружающих нас бактерий являются некультивируемыми. Их практически невозможно вырастить в колбе или на чашке Петри в виде «чистой культуры». Причин этому может быть, несколько: бактерии нуждаются в специфических ростовых факторах, отсутствующих в стандартных средах (такие факторы производят, например, бактерии-симбионты); медленно растущие бактерии не выдерживают конкуренции с быстрорастущими видами; будучи извлечёнными из привычной среды, некоторые микроорганизмы впадают в спячку и становятся дормантными, и т. д. Между тем, в организме хозяина некультивируемые бактерии могут вызывать инфекцию не менее эффективно, чем культивируемые патогены. Поэтому как для диагностики, так и для разработки терапии важно идентифицировать эти микроорганизмы и затем все-таки найти метод их культивирования. Кроме того, некультивируемые бактерии могут быть и источником принципиально новых антибиотиков.

Идентификация таких микроорганизмов стала возможной благодаря развитию метагеномного секвенирования, в котором классификация присутствующих в образце многочисленных видов бактерий проводится на основании изучения различий в ультраконсервативных РНК, например, в рибосомной 16S РНК. Следующим шагом, позволившим проводить не только идентификацию, но и выделение таких микроорганизмов, стало развитие методик изолированного полногеномного секвенирования ДНК единичной бактериальной клетки. До сих пор сложно просеквенировать каждый вид бактерий, находящийся в образце, однако интересующий микроорганизм или группу микроорганизмов, несущих определённые признаки, можно выделить, используя микрофлюидику. Таким образом из ротовой полости человека был выделен штамм, названный TM7, представитель группы Saccharibacteria, многие члены которой были идентифицированы в активном иле из канализационных стоков. У человека наличие бактерий из данной группы в ротовой полости коррелирует c развитием периодонтита и воспалением кишечника.

В новой работе исследователи изучили геном штамма TM7 и выделили в его составе два белка, с высокой вероятностью связанные с мембраной бактерий и экспонированные в окружающую среду. Свойства белков и их структура были предсказаны на основе анализа гомологичных белков других микроорганизмов. Эти белки были использованы для получения специфических антител, потенциально способных «пометить» внешнюю поверхность живых клеток штамма TM7. И действительно, пептидные фрагменты, сконструированные на основе моделей структур предсказанных внеклеточных фрагментов белков, индуцировали антитела, специфически взаимодействующие с поверхностью TM7. Антитела были использованы для выделения бактерий методом флуоресцентного сортинга (fluorescence-activated cell sorting, FACS). Геномное секвенирование отсортированных бактерий показало, что более 95% ДНК принадлежит группе Saccharibacteria, валидировав таким образом технологию выделения. Остальная ДНК принадлежала небольшому числу групп микроорганизмов, что дало основания предполагать наличие адгезии между ними и Saccharibacteria.

Последующее культивирование подтвердило, что вместе с выделенными Saccharibacteria происходит рост стрептококков и актинобактерий. Авторы предположили, что стрептококки выделяются совместно с остальными бактериями ввиду их высокой неспецифической адгезивности. Вместе с тем, один из видов актинобактерий, Cellulosimicrobium cellulans, ко-культивировался с бактериями TM7 и после нескольких раундов роста и FACS. Совместные культуры этих бактерий росли в различных условиях и возобновляли совместный рост после глубокой заморозки. В процессе культивирования и сортировки исследователями были обнаружены несколько вариантов представителей группы TM7, культивировавшихся исключительно в симбиозе с различными актинобактериями. Культивирование TM7 без актинобактерий было невозможно.

Разработанная методика была названа авторами «обратной геномикой», поскольку идентификация и выделение бактерий проводились на основании метагеномных данных, в сторону, «обратную» классическому процессу идентификации бактерий, при котором происходит выделение чистой культуры и лишь затем секвенирование ДНК. Новая технология позволяет не только выделить ряд «некультивируемых» микроорганизмов, но и осуществить их культивирование в пробирке за счёт выделения бактерий-симбионтов или «хозяев». Авторам работы удалось получить ещё один «некультивируемый» микроорганизм, обозначенный как SR-1. Эти бактерии также культивируются исключительно в сообществе с бактериями, продуцирующими ростовые факторы, поддерживающие размножение других микроорганизмов. Таким образом, становится понятным, что многие микроорганизмы разных видов формируют сложные сообщества и обмениваются ростовыми и сигнальными факторами, без которых их культивирование в пробирке, а, следовательно, и изучение, затруднено или невозможно.

Источник

Cross C. L et. al. // Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics // Nature Biotechnology, 2019; DOI: 10.1038/s41587-019-0260-6

Добавить в избранное

Вам будет интересно