Константин Северинов: «Cas13 — это самонаводящаяся ракета, которая взрывается только тогда, когда попадает в мишень»

Молекулярный биолог Константин Северинов — о разнообразии систем клеточной защиты бактерий, тестах на основе систем CRISPR-Cas, особенностях их патентования и о том, почему с помощью CRISPR пока нельзя исправлять гены прямо в организме.

Константин Северинов — специалист в области молекулярной биологии (регуляция транскрипции генов бактерий и их взаимодействия с бактериофагами), руководитель научных программ АНО «Развитие генетических технологий», профессор Ратгерского университета (Нью-Джерси, США) и Сколковского института науки и технологий, заведующий лабораторией в Институте молекулярной генетики РАН.

CRISPR «у себя дома»: самое интересное и сложное

Что интересного сейчас происходит в фундаментальной науке о CRISPR? Что-то, может быть, не нашедшее практического применения?

Системы CRISPR-Cas используются бактериями для защиты от вирусов. Существует два класса CRISPR-систем, они подразделяются на шесть типов. Системы разных классов эволюционно не родственны друг другу, а системы разных типов одного класса сильно отличаются по механизмам защитного действия. Реальное технологическое приложение в геномном редактировании получили системы второго класса, прежде всего системы на основе белка-эффектора Cas9 — это класс 2, тип II. В последнее время вырос интерес к системам класса 2, типа VI, которые, в отличие от других систем, в качестве мишени используют РНК. На основе этих систем был разработан новый метод экспресс диагностики SHERLOCK.

С исследовательской точки зрения крайне интересна система класса 1 типа III. Она имеет удивительное свойство — ее эффектор, РНК-запрограммированная Cas-нуклеаза, узнает транскрипт РНК в то время, когда он синтезируется РНК-полимеразой по ДНК, то есть котранскрипционно. После того, как происходит узнавание, включается специальная активность: эффектор начинает разрушать вокруг себя и ДНК, и РНК. Биологический смысл такого механизма действия не до конца понятен. Но исследование этих систем позволило открыть совершенно новый пласт клеточной регуляции за счет малых олигонуклеотидов, которые синтезируются в клетке в ответ на узнавание эффектором РНК. Эти олигонуклеотиды понижают способность активированного эффектора неспецифически расщеплять нуклеиновые кислоты. Таким образом, возникает обратная связь, ведь иначе неконтролируемое расщепление клеточной РНК и ДНК приведет к гибели клетки. О существовании такого рода регуляции раньше никто не знал, ее активно изучают. Выясняется, что очень многие системы защиты бактерий используют маленькие сигнальные молекулы, чтобы сигнализировать о наличии вирусной инфекции и регулировать клеточный ответ на нее. Это первое.

Второе: во многих лабораториях изучают процесс адаптации CRISPR-Cas-систем. Для защитных действий этих систем необходимо, чтобы клетка вставила короткий фрагмент вирусной ДНК в свою собственную ДНК. В результате такой вставки-адаптации она и ее потомки приобретут защиту от инфекции. Защиту обеспечивают генетические элементы бактерии — их называют CRISPR-кассетами, — которые содержат участки, соответствующие приобретенным фрагментам вирусной ДНК. В некотором смысле, поведение CRISPR-Cas-систем при адаптации ламарковское, ведь чтобы получить устойчивость к вирусу, надо сначала им заразиться, а затем «приобрести», адаптировать фрагмент ДНК вируса, встроив его в CRISPR-кассеты клетки. Молекулярный механизм адаптации до конца не изучен, его детали, по-видимому, сильно отличаются в системах разного типа, и его продолжают исследовать.

Кроме собственно научного интереса, исследование адаптации может иметь и практические выходы, довольно причудливые. Некоторое время назад Джордж Черч [американский генетик, известный своими работами по технологиям секвенирования, геномике и синтетической биологии. — PCR.news] показал, что адаптацию, то есть вставку чужеродных участков ДНК в CRISPR-кассеты, можно использовать для создания «памяти на ДНК» и передачи информации. Можно кодировать разные сообщения, включая видеозаписи.

Другое применение, связанное с передачей информации с помощью CRISPR, основано на их использовании для записи информации в ДНК в виде мутаций. CRISPR-эффектор узнает и раскусывает участок ДНК, кодирующий ту самую гидовую РНК, которая используется для программирования эффектора. Такой выверт приводит к тому, что в участке, кодирующем гидовую РНК, накапливаются мутации, и возникают новые, измененные гидовые РНК, которые будут стимулировать возникновение следующего поколения мутаций, — и так далее, процесс может идти долго. Такая системы записи позволяет создать счетчик времени, с помощью которого можно отслеживать клеточные линии, возникающие при развитии эмбриона. По сути, родственной технологией является использование CRISPR-систем для организации генетических драйвов, которые направленно меняют частоту встречаемости определенных генотипов в целых популяциях, например, изменяют соотношение в них самцов и самок.

Первоначально предполагалось, что CRISPR-Cas системы имеют защитную функцию именно потому, что CRISPR-кассеты несут в себе вставки (их называют спейсерами) из вирусов. Выясняется, что на самом деле лишь очень малая часть всех известных спейсеров соответствуют каким бы то ни было вирусам. Подавляющее большинство спейсеров ничему в базах данных не соответствуют, и это вызывает вопрос: «Что бы это значило, откуда они берутся?» Возможно, эта «темная материя» спейсеров возникает из неизвестных вирусов и других мобильных генетических элементов. Но тогда количество неизвестных науке мобильных генетических элементов и вирусов должно быть совершенно зашкаливающим. Другая возможность — такие спейсеры не соответствуют ничему, а возникают de novo, но тогда встает вопрос о механизме, который ответственен за их возникновение. Это могло бы быть похожим на генерацию разнообразия антител с помощью V(D)J-рекомбинации или еще на что-нибудь, но сейчас ответа нет.

У вас была совместная работа с литовским биохимиком Виргиниюсом Шикшнисом по BREX — системе бактериального иммунитета, отличной от CRISPR. Что она собой представляет, и сколько иммунных систем у бактерий и архей можно предположить или насчитать?

Я не думаю, что можно назвать какое-то число, оно в некотором смысле бесконечно. Эволюция прокариот и их вирусов продолжается миллиарды лет. Тот факт, что и те, и другие существуют, означает, что между ними происходит постоянная гонка вооружений, на каждое средство атаки, «придуманное» вирусами, выжившие клетки ответили, «придумав» средство защиты. Вирусы, в свою очередь, должны ответить новым средством атаки. Такого рода молекулярные средства нападения и защиты могут быть самыми разнообразными. Этот процесс продолжается очень долго; каждая клетка и вирус, ее заражающий, должны решить эту проблему или погибнуть. С другой стороны, раз возникнув, такие системы, если они успешные, могут распространяться довольно быстро между бактериями или вирусами за счет горизонтального переноса генов, который особенно характерен для защитных генов. Те же самые CRISPR-Cas-системы распространяются за счет горизонтального переноса, поэтому эволюционное дерево CRISPR-Cas-систем не совпадает с эволюционным деревом бактерий, в геномах которых они находятся.

Насчет BREX: мы с Виргисом вместе опубликовали статью о системе, на самом деле очень похожей на систему Pgl, которая впервые была описана в 1980-е годы советскими учеными из ВНИИ генетики. Это был прекрасный институт в былые времена. Конкретный вариант системы, который изучили мы, был предсказан подходом guilt-by-association. Каждая система защиты, во-первых, должна иметь способ определить «своего» и «чужого», отличить свою нуклеиновую кислоту от вирусной. И во-вторых, система должна уметь уничтожить чужеродный объект после его идентификации. Так вот, мои аспиранты Юля Гордеева и Артем Исаев показали, что BREX отличает «свое» от «чужого» на уровне метилирования ДНК. Этим она похожа на хорошо известные системы рестрикции-модификации. А как именно в клетках с BREX-системой после узнавания чужеродной вирусной ДНК, которая не метилирована, в отличие от метилированной клеточной ДНК, происходит подавление развития вирусов — до сих пор не понятно. В системах рестрикции-модификации немодифицированная ДНК вируса просто расщепляется теми самыми нуклеазами рестрикции, которые используются в клонировании. Система BREX не содержит генов, кодирующих очевидные нуклеазы. Поэтому механизм уничтожения чужеродной ДНК должен быть иной, а какой именно, мы не знаем, но активно над этим работаем.

Получается, что практическое применение BREX сейчас невозможно?

Да, и это относится к подавляющему большинству других систем защиты. Большинство из них нам неизвестно, среди известных большинство не изучено. Некоторые из изученных довольно интересные. Например, они влияют на энергетический потенциал клетки в случае заражения. Есть сенсор, который детектирует заражение, а потом у клетки мгновенно исчезает восстановительный потенциал. И после этого она не может поддержать развитие вируса, но и делиться и расти тоже не может. Зараженная клетка умирает, но вся популяция клеток от этого выигрывает, так как инфекция не распространяется. По принципу действия похоже на Александра Матросова — альтруистическая смерть в схватке с общим врагом. Я думаю, что на волне интереса к CRISPR-Cas сообщений о новых защитных системах будет все больше и больше. Почти все они сначала предсказываются «на кончике пера» методами биоинформатики, а потом их защитное действие подтверждается экспериментально. Какие-то из них будут охарактеризованы, но далеко не все получат практическое применение. Таким образом перегретые ожидания, вызванные успехом CRISPR помогают развиваться нормальной, не терпящей суеты науке.

Собственно, это хорошо видно на примере систем рестрикции-модификации. В молекулярном клонировании используются ферменты самого простого, второго типа систем рестрикции-модификации. А более сложные системы первого и третьего типов никакого практического применения не нашли. Но при этом с точки зрения фундаментальной науки они оказались гораздо более интересными.

 CRISPR-Cas9 Credit: Huan Gaertner | 123rf.com

Поиск и патенты

Вы упомянули подход guilt-by-association. Ваша команда создала поисковую систему, которая обнаруживает новые CRISPR-Cas-системы. Расскажите о ней, насколько она уникальна?

Эта система была создана Сергеем Шмаковым, который сейчас работает научным сотрудником у Евгения Кунина, а тогда был моим аспирантом в Сколтехе, и она продолжает модифицироваться. Сергей создал алгоритм, он не был первым, но он сделал его очень удобным. Общий подход называется guilt-by-association, буквально «вина по ассоциации», то есть «вина» — причастность к некой функции — доказывается ассоциацией и близостью одного гена к другому гену. С помощью такого метода можно, в частности, искать новые CRISPR-Cas системы.

Понятно, что эта деятельность когда-то подойдет к концу, но она продолжает быть полезной. Всякий раз, когда увеличивается количество последовательностей в базе данных, а оно растет очень быстро, имеет смысл поискать, не появилась ли там новая CRISPR-Cas система, не похожая ни на одну из известных. У нее могут быть какие-то свойства, интересные в фундаментальном или практическом смысле. Компании и ученые, которые ищут новые редакторы, пользуются в той или иной степени подходом и программным обеспечением, которое разработал Сергей.

В декабре вышла статья, соавтором которой вы являетесь, про компактный ортолог Cas9. Чем он замечателен?

Это статья другой аспирантки, Яны Федоровой. Сама идея заключается в том, что CRISPR-редактор для успешного применения должен быть относительно маленьким, тогда его ген будет удобно паковать в аденовирусные частицы. Кроме того, он должен обладать достаточно высокой активностью в эукариотических клетках. Необходимо также, чтобы он узнавал PAM — последовательность, которая контролирует взаимодействие с мишенью, — отличный от тех, которые узнаются уже используемыми редакторами. В упомянутой вами статья мы описали редактор, удовлетворяющий всем этим требованиям. Мы уже получили запрос на его лицензирование от ведущей американской компании.

И более давняя работа, 2016 года, где в числе авторов были вы, Евгений Кунин и Фэн Чжан: открытие нуклеазы С2с2, которая теперь называется Cas13a. Как это произошло? Было ли это планомерное изучение разнообразия CRISPR-Cas или счастливая случайность?

Это тот самый случай, когда нуклеазу открыл снифер, поисковик, который был запущен Сергеем Шмаковым в имевшуюся тогда базу данных по ассоциации с геном белка Cas1, единственного, объединяющего все известные CRISPR-Cas системы. Это белок, ответственный за адаптацию новых спейсеров. Была найдена группа последовательностей, в которой рядом с геном, кодирующим нечто похожее на Cas1, находился довольно большой ген, не похожий ни на Cas9, ни на одну из других ДНК-нуклеаз. В экспериментах, проведенных сотрудниками Фэна и сотрудниками моей лаборатории в Ратгерсе, выяснилось, что это РНК-нуклеаза, что эта система «узнает» РНК, которые комплементарны гидовой РНК, связанной с эффектором. Узнавание РНК-мишени приводит к тому, что активируется нуклеаза, которая «раскусывает» любую РНК, находящуюся поблизости. На этом основан SHERLOCK.

SHERLOCK — это тест-система Фэна Чжана, и есть еще диагностические разработки в КНР тоже на Cas13а. Кому сейчас принадлежат патенты на системы CRISPR-Cas13а?

Исходные патенты на Cas13 принадлежат MIT, Национальным институтам здравоохранения США, университету Ратгерса, какая-то доля принадлежала Сколтеху. Это несколько патентов, они лишь часть большого пакета патентов, которые создают необходимую защиту для технологии. Но само по себе наличие этих патентов, по крайней мере в российской реальности, мало что означает. Я точно знаю, что целый ряд российских компаний, а также недавно созданные генетические центры заняты не то чтобы изобретением велосипеда, но создают свои собственные варианты SHERLOCK. Даже при повторении технологии можно ее улучшить. Мы также работаем над улучшением чувствительности SHERLOCK, есть соображения, как можно сильно поднять его эффективность. Есть способы, как сочетать SHERLOCK с иммунологическими методами.

Как патентуют системы CRISPR-Cas? У разных микроорганизмов свои гены-ортологи, есть различные Cas-нуклеазы с аналогичной функцией. Может ли любой желающий взять аналогичный белок другого микроорганизма и считать его патентно чистым?

Для академической деятельности патенты вообще не нужны. Вы можете заказать интересующую вас плазмиду из общедоступного хранилища в США или запросить ее у авторов и спокойно ее использовать. Если вы — компания и собираетесь использовать системы для извлечения прибыли, вам придется платить роялти правообладателю. С другой стороны, если вы хотите использовать свой редактор, то вам необходимо его получить как новую последовательность и охарактеризовать продукт. Для этого вы не можете просто делать биоинформатические поиски по публичным базам данных. Вам нужно создавать собственные базы данных последовательностей, например, путем метагеномного секвенирования ДНК, полученных из тех или других природных образцов. И затем надеяться найти в них что-то, что будет обладать какими-то интересными свойствами.

А что насчет системы DETECTR компании Mammoth Bioscience, сооснователь которой — Дженнифер Дудна? Она на той же идее, что и SHERLOCK?

Идея DETECTR та же, что у SHERLOCK. У Дженнифер метод основан на эффекторе типа V, белке Cas12, который распознает ДНК и затем «раскусывает» другие ДНК за счет collateral damage — сопутствующего ущерба, подобно тому, как Cas13 работает по РНК. Возможной аналогией эффекта collateral damage является запуск ракеты в густонаселенный город: погибнут не только вражеские солдаты, но и гражданские, все, кто был рядом. И Cas12, и Cas13 — это умные самонаводящиеся ракеты, которые взрываются только тогда, когда попадают в, соответственно, ДНК- или РНК-мишень. Если не попала, то есть если врага нет, то не взрывается. И в DETECTR, и в SHERLOCK нуклеазная активность, наведенная узнаванием мишени, высвобождает флуоресцентный сигнал из какой-нибудь нуклеиновой кислоты [с флуоресцентной группой и гасителем на разных концах молекулы, которые удаляются друг от друга, когда она разрезана. — PCR.news].

В реальном биологическом контексте системы с collateral damage в ходе своего защитного действия предотвращают рост зараженной клетки, а заодно подавляют производство вирусов. В частности, поэтому система Cas13 VI типа, которая действует на РНК, ограничивает размножение не только РНК-вирусов, но и ДНК-вирусов. Узнав РНК, транскрибированную с генома ДНК-вируса, эта система разрушает всю РНК клетки, таким образом, ДНК-вирус также не может размножиться.

На основе этой нуклеазы можно создать лекарство?

Вы можете делать чувствительную диагностику. В отличие от ПЦР диагностика на основе Cas13 и Cas12 — это изотермические процессы. Это их важное достоинство: не нужно специальных приборов. Они в некотором смысле похожи на серологические экспресс-тесты, которые можно просто сделать на бумажке. Но всякий раз, когда вы говорите про лекарство, вам нужно решать проблему доставки. А она не решена. Вообще. Для любого редактора. Пока что, по крайней мере.

То есть он не влезет в аденовирус?

И белки Cas13/Cas12, и их гены могут быть запакованы в аденовирусные частицы, но для действительно эффективного лечения вам нужно обеспечить их гарантированную доставку в те клетки, которые вас интересуют. В общем случае эта задача не решена.

Константин Северинов. Зальцбург.
Фото из личного архива

Дальнейшие планы

А что сейчас в России с CRISPR-биотехнологиями? Есть ли собственные разработки, о которых стоит говорить?

К сожалению, разработок немного. Если снова говорить о себе — мы только что закончили контракт с Министерством науки и высшего образования на сумму больше сотни миллионов рублей, с компанией «Биокад» в качестве индустриального партнера. Наша задача заключалась в том, чтобы найти новые CRISPR редакторы, которые обладали бы патентной чистотой, охарактеризовать их, запатентовать и лицензировать их компании «Биокад» для дальнейшего использования. При этом мы пользовались биоинформатическими алгоритмами, разработанными, в частности, Сергеем Шмаковым, для предсказания новых CRISPR-Cas редакторов и их экспериментального подтверждения методами, исходно созданными в лаборатории Фэна Чжана. Яна Федорова провела год в лаборатории Фэна, и поэтому у нас все методы оказались поставленными и работающими.

В каких направлениях предполагается их использование, если не секрет?

В данном случае направления для нас не важны. Мы выдаем «на-гора» новые редакторы, которые не находились в публичных базах данных. Используем для этого свои собственные метагеномные образцы, ищем именно там, ведь искать то, что уже есть в базах данных, бессмысленно, это невозможно запатентовать. И после того, как мы их находим, проведя метагеномное секвенирование, потом биоинформатический поиск, мы их характеризуем с точки зрения эффективности, точности, способности работать в клетках эукариот и обладания какими-то новыми свойствами. Такой редактор может быть в дальнейшем использован для геномного редактирования самых различных клеток, в зависимости от того, что хочет заказчик.

Вы работаете и в России, и в США. Как пандемия повлияла на вашу работу? Есть задачи, которые не решаются дистанционно, а требует личного участия?

Я давно не работаю руками. У меня есть сотрудники, которые работают и в Москве, и в Петербурге, и в Нью-Джерси. Мы сейчас больше общаемся, чем раньше, постоянно дистанционно обсуждаем и эксперименты, и результаты, и статьи других ученых — обычно у меня в день два-три семинара, кроме собственно учебных лекций. В принципе, научная деятельность, при условии, что кто-то может попасть в лабораторию и там проводить исследования, может осуществляться в режиме «удаленки», по крайней мере, на уровне координации процесса, обсуждения результатов, планирования новых экспериментов, написания статей и грантовских заявок. Собственно, все научные сотрудничества именно так происходили — по удаленке — задолго до пандемии. С большинством из коллег из других лабораторий, с которыми у меня есть совместные статьи, я никогда не встречался. Все ограничивалось электронными письмами, телефонными разговорами и т.д.

«Роснефть» стала главным технологическим партнером программы создания в России трех геномных центров мирового уровня. Вы участвуете в этом проекте?

Да, я работаю в структурах, связанных с ПАО «НК «Роснефть», и отвечаю за выполнение обязательств компании в области партнерства с государством в сфере генетических технологий.

Добавить в избранное

Вам будет интересно