Как произвести терапевтический олигонуклеотид? «ГенТерра» делится опытом

В рамках саммита Сириус.Биотех — впервые в его истории — состоялась секция, посвященная терапевтическим олигонуклеотидам. Короткие (из десятков «букв») молекулы нуклеиновых кислот становятся активными компонентами лекарств, и среди них с большим отрывом лидируют антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) и малые интерферирующие РНК, которые подавляют активность генов-мишеней или управляют сплайсингом мРНК для восстановления синтеза «правильного» белка.

В мире десятки компаний разрабатывают и производят лекарственные препараты на основе олигонуклеотидов — и специализированные в этом направлении, такие как Ionis Pharmaceuticals и Alnylam Pharmaceuticals, и фармгиганты Johnson & Johnson, Roche, Novartis, AstraZeneca. Более 20 препаратов уже зарегистрировано, и более 120 проходят клинические исследования.

На цветных иллюстрациях в научных статьях механизмы действия олигонуклеотидов выглядят просто и элегантно. Однако на этих иллюстрациях обычно не фигурируют важные технические моменты. Реальность всегда сложнее теории, и недаром от первых идей о терапевтических олигонуклеотидах до первых разрешенных препаратов прошли десятилетия. Жизнь чужеродной нуклеиновой кислоты в нашем организме непродолжительна, и как сделать, чтобы РНК не деградировала быстрее, чем выполнит свою задачу? Каким образом олигонуклеотид попадет в клетку-мишень, где надо подавить активность гена, и не повредит ли он другим тканям? Как вообще он сможет проникнуть через липидную мембрану клетки, если фосфатные группы нуклеиновых кислот отрицательно заряжены, а молекула гидрофильна? Наконец, как синтезировать и очистить олигонуклеотид, чтобы потенциальное лекарство было безопасным?

Сегодня у наших читателей есть возможность подробнее узнать о том, как получают терапевтические олигонуклеотиды. Платформу для их производства разработала российская компания АО «ГенТерра».

Александр Челкин, заместитель генерального директора по научно-производственной деятельности компании, рассказал о том, зачем модифицируют терапевтические нуклеиновые кислоты и какие препараты на основе НК сейчас набирают популярность, а также о технологиях синтеза и очистки олигонуклеотидов и о том, что необходимо для их масштабирования. Производство терапевтических олигонуклеотидов в «ГенТерре» уже налажено, размер партии может достигать 50 г.

Если АСО — это одноцепочечные молекулы РНК, то малые интерферирующие РНК — двухцепочечные. Но у них общие проблемы, связанные с доставкой: нативные РНК нестабильны во внутренней среде организма и не могут проходить через клеточную мембрану из-за отрицательного заряда.

Стабильность терапевтических РНК повышают химические модификации нуклеотидов. Типичные примеры модификаций — замена фосфата на тиофосфат, свободной 2’-гидроксильной группы остатка рибозы — на фтор или метоксигруппу.

Кроме того, олигонуклеотид может быть конъюгирован с гидрофобной молекулой, легко проникающей через липидную мембрану и улучшающей фармакокинетику и биораспределение, или с молекулой, которая специфически распознает тот или иной рецептор на поверхности клетки-мишени.

В настоящее время очень популярны конъюгаты с N-ацетилгалактозамином (GalNAc). Это соединение замечательно тем, что селективно связывается с асиагликопротеиновым рецептором гепатоцитов (клеток печени) и способствует доставке олигонуклеотида именно в эти клетки. Печень — «биохимическая фабрика» организма, воздействие на ее ферменты эффективно при самых разных нарушениях метаболизма.

Стоит учесть, что доля коротких интерферирующих РНК среди одобренных препаратов быстро растет. Конъюгаты терапевтических РНК с GalNAc предложили в Alnylam, а сегодня используют и многие другие компании (в том числе Wave Life Sciences, которая разрабатывает подходы, основанные на редактировании мРНК).

Среди разрешенных препаратов становится все больше РНК, конъюгированных с GalNAc. Давайте рассмотрим люмасиран, как типичный представитель этого класса молекул. По данным 2021 года в России было около 30 детей с первичной гипероксалурией первого типа, которым мог бы помочь такой препарат.

Люмасиран — активный компонент одобренного в Европе и США лекарственного препарата против первичной гипероксалурии 1 типа, редкого наследственного заболевания, при котором в организме повышается концентрация оксалатов — солей щавелевой кислоты. Его причиной являются мутации в гене фермента AGXT, участвующего в метаболизме предшественника оксалата — глиоксилата, Оксалаты активно выводятся почками, и это приводит к образованию камней. Люмасиран представляет собой короткую интерферирующую РНК (окончание «сиран» международных непатентованных наименований лекарств этого типа как раз и происходит от siRNA — small interfering RNA). Он взаимодействует с мРНК другого фермента — гликолатоксидазы 1 и снижает уровень самого глиоксилата. 

Промышленная схема производства люмасирана на первый взгляд кажется простой. Она начинается с синтеза носителя, на котором иммобилизован тример GalNAc (tri-GalNAc). Смысловая и антисмысловая цепи синтезируются отдельно, проходят очистку и концентрирование с помощью ультрафильтрации. Затем проводят отжиг дуплекса и лиофилизация. В результате получается химическое сырье, готовое к использованию как в фармацевтике, так и в лабораторных исследованиях. Однако на каждом этапе есть свои сложности, и только система контроля качества и валидация всех процессов обеспечивает воспроизводимый результат, подчеркнул докладчик.

GalNAc синтезируется в «ГенТерре», этот этап пришлось воспроизводить на своей площадке, поскольку купить его в РФ сейчас крайне непросто. Но в этом есть и преимущество: самостоятельное проведение синтеза позволяет контролировать чистоту продукта, при необходимости добавляя этапы очистки, и не допускать на следующие этапы критические примеси, которые в итоге останутся в олигонуклеотиде. Также это позволяет существенно снизить себестоимость конечного продукта.

Входной контроль качества сырья — необходимый этап, и здесь существуют свои трудности. На рынке представлено широкое разнообразие реагентов, разнородных по качеству и составу возможных примесей. Поэтому одним из ключевых приемов становится функциональный контроль. «Мы просто делаем тестовый синтез, и если нам не нравится результат, мы дальше ничего не берем», — сказал Александр Челкин. Разумеется, на каждом этапе качество продукта контролируется методами хроматографии и масс-спектрометрии.

Отличительная особенность синтеза олигонуклеотидов — цикличность процесса. Чтобы присоединить к цепочке очередное звено, нужно удалить с ОН-группы предыдущего нуклеотида диметокситритильную группу, присоединить следующий нуклеотид, защитить непрореагировавшие ОН-группы и провести другие необходимые реакции, а затем повторить все сначала, 20–30 раз.

Примеси в таком циклическом синтезе накапливаются на каждой стадии и в итоге суммируются, поэтому эффективность каждого цикла и каждого шага внутри него необходимо повышать до возможного максимума.

Ожидаемо главной примесью становится другие олигонуклеотиды, например, укороченные на одно-два звена по сравнению с целевым продуктом, имеющие лишнее звено или потерявшие атом серы. От этих примесей позволяет избавиться хроматографическая очистка, причем необходимо одновременно добиться высокого выхода продукта и хорошего профиля примесей.

Александр Челкин специально остановился на масштабировании. При каждом увеличении размера серии на один порядок приходится оптимизировать или даже менять технологию; «каждый раз, когда хотите существенно увеличить масштаб, необходимо заниматься новыми разработками».

Финальный этап — отжиг дуплекса, то есть взаимодействие двух комплементарных цепей — молекулярным биологам кажется предельно простым, «слить и перемешать». Однако в производстве медицинского препарата все не так просто: в нем не должны присутствовать свободные сенс- и антисенс-цепи, это неприемлемо с точки зрения безопасности. Иначе говоря, примесью считается каждая отдельная цепь, не образовавшая дуплекс. Пришлось разрабатывать специальные методы, чтобы избавиться и от этой «примеси».

Контроль качества готовой продукции — отдельная задача, так как олигонуклеотиды сложно анализировать, и для этого используются методы, не всегда привычные для производства. В «ГенТерре» провели специальную работу, чтобы иметь возможность передать производителю не только готовый продукт, но и готовые методики контроля качества, подчеркнул докладчик. Помимо хроматографических и масс-спектрометрических анализов выполняется тандемная масс-спектрометрия, которая подтверждает не только состав олигонуклеотида, но и его последовательность. Еще одна особенность данного класса препаратов — если порядок нуклеотидов отличается от заданного, масса молекулы может не измениться, поэтому нужны независимые методы подтверждения, что «буквы» стоят в нужном порядке.

Наконец, необходимо гарантировать микробиологическую чистоту и отсутствие эндотоксинов. Очистка от микробиологического загрязнения приводит к значительным потерям продукта, поэтому лучше его не допускать. Это обеспечивают чистые производственные помещения (центральная система водоподготовки, шлюзы, направленный перепад давления воздуха «от чистого к грязному» и т.д.).

Таким образом, разработанная в «ГенТерре» платформа дает возможность производить качественные олигонуклеотиды, конъюгированные с GalNAc, на территории РФ, как для исследовательских целей, так и для производства медицинских препаратов, дженериков либо оригинальных.

После доклада мы задали Александру Челкину несколько вопросов.

Расскажите немного об истории медицинских продуктов «ГенТерры». Ваша компания работала в этом направлении уже в начале 2020-х?

Да, и «ГенТерра» активно развивалась все это время не только с точки зрения объемов синтезируемых олигонуклеотидов, но и с точки зрения сложности их структур, модификаций и конечной чистоты. Сегодня мы готовы обеспечить российский рынок олигонуклеотидами практически любой сложности и чистоты.

Люмасиран — это коммерческий заказ?

Нет, данная молекула была выбрана как демонстрационная модель наших возможностей.

А если все-таки рассмотреть на его примере, какое количество малой интерферирующей РНК для производства лекарства может понадобиться больным детям? Хотя бы по порядку величин — граммы, десятки граммов?

Исходя из количества больных в РФ и дозы препарата, речь идет не более чем о нескольких десятков граммов в год. В то же время для других лекарственных средств разброс потребностей в год может варьироваться от граммов до килограммов.

Кто ваши клиенты, заинтересованные в терапевтических олигонуклеотидах?

Это не только биотехнологические и фармацевтические компании, но и очень многие исследовательские институты. «ГенТерра» контролирует чистоту промежуточных и конечных продуктов, за счет чего наши олигонуклеотиды пользуются спросом на всех стадиях исследований от in vitro до in vivo.

После вашего доклада многие слушатели задавали вопросы про очистку и безопасность олигонуклеотидных препаратов, про требования регуляторов.

Для олигонуклеотидов как класса терапевтических молекул эти вопросы стоят очень остро. Это очень молодое направление, и весь мир не до конца договорился о критериях контроля этих молекул в процессе регистрации их как лекарственных средств. Не всегда применимы подходы для малых молекул, которые уже стали всем знакомы, в том числе и в РФ. Но чем больше будет появляться таких молекул, тем привычнее они станут как для фармацевтических производителей, так и для регулятора. В целом сейчас используется довольно простой подход: во-первых, эти молекулы однозначно признаются синтетическими, а не биологическими, а во-вторых, везде, где применимы классические аналитические методы и требования фармакопей — они применяются. Немного обособленно стоит масс-спектрометрия, как один из ключевых методов контроля — и именно здесь «ГенТерра» обладает наибольшими компетенциями.

Доклад явно вызвал интерес. У вас были плодотворные встречи на саммите?

Доклад действительно заинтересовал многих, особенно представителей фарминдустрии. Было много встреч и обсуждений как во время саммита, так и после него. Хочется выразить огромную благодарность Сириусу и организаторам саммита — все было проведено на очень высоком уровне. Я надеюсь, что это мероприятие будет продолжаться из года в год и развиваться. Это очень важно, что есть такая площадка, где могут встретиться представители науки, CRO-компании наподобие нашей и крупные фармацевтические компании, обмениваться опытом, идеями и находить области для сотрудничества.

Реклама. Рекламодатель АО "ГенТерра" ИНН 7728896265

Другие материалы с «Сириус.Биотех»-2025

Роман Иванов: «Хочется заниматься самыми передовыми технологиями»

Терапевтические олигонуклеотиды в России