Терапевтические олигонуклеотиды в России

erid:2VfnxwBbpwz

К концу первой четверти XXI века всем хорошо известно, что роль РНК в клетке состоит не только в обслуживании синтеза белков. Регуляция экспрессии генов с помощью некодирующих РНК крайне важна и в норме, и при различных патологиях. Терапевтические РНК, действующие по принципу РНК-интерференции, открыли новое направление в биомедицине. А еще существуют аптамеры — молекулы нуклеиновых кислот, которые в некотором смысле вторгаются в «нишу» белков: их эффект опосредован трехмерной структурой молекулы, а не линейной последовательностью нуклеотидов.

В конце мая на саммите «Сириус.Биотех» — впервые в его истории — состоялась секция докладов, посвященная терапевтическим олигонуклеотидам. Докладчики рассмотрели ключевые темы, важные для развития этого направления высокотехнологичной медицины.

Елена Завьялова (химический факультет МГУ) рассказала о ДНК-аптамерах, способных взаимодействовать с вирусами гриппа.

Аптамеры на основе нуклеиновых кислот — это олиго- и полинуклеотиды (15–100 нуклеотидов) с уникальной 3D структурой, способные связывать белки-мишени. По функциональной точности они подобны антителам, при этом их аффинность к мишеням очень высока (константа диссоциации может достигать 10^-12–10^-9 М). Аптамеры производят с помощью автоматического химического синтеза, и в них легко вводить разнообразные модификации. Среди трехмерных структур аптамеров, взаимодействующих с белком, — G-квадруплексы, дуплексы, неканонические пары, включая триплексы, а также петли.

Аптамеры для определенной цели получают селекцией библиотек ДНК с помощью процедуры SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponent Enrichment), которая немного похожа на аффинную хроматографию. Она включает связывание потенциальных аптамеров с мишенью, пришитой к носителю, элюцию, амплификацию, оценку эффективности, а затем цикл повторяется.

В списке мишеней, для которых уже получены аптамеры, — наркотические и взрывчатые вещества, метаболиты, катионы металлов, самые разнообразные белки, включая компоненты вирусов и бактерий, токсины, белки опухолевых клеток. Зарегистрированы первые лекарственные средства на основе аптамеров, диагностические наборы, в том числе для выявления коронавируса.

Докладчица рассказала про аптамеры к гемагглютинину вируса гриппа А. Эти вирусы известны своей изменчивостью и широкой вариабельностью, которая позволяет им избегать нейтрализации антителами и заражать даже тех, кто переболел гриппом в прошлый сезон.

Тем не менее удалось найти аптамеры с высокой аффинностью к гемагглютининам различных штаммов человеческого и птичьего гриппа: RHA0385,  BV42. Аптамеры распознают консервативный участок в их составе. Вероятно, этот участок перекрывается с сайтом связывания сиаловых кислот (компонентов клеточных рецепторов), потому что при добавлении аптамера вирус перестает связываться с клетками.

Однако для ингибирования инфекционной способности вирусов нужны значительные концентрации аптамеров — примерно микромолярные. При существующей стоимости синтеза нуклеиновых кислот такие лекарства были бы недоступными для широкого применения. Намного меньшие количества аптамеров требуются для создания биосенсоров.

Докладчица с коллегами разработали сенсор для выявления вируса гриппа А на основе гигантского комбинационного рассеяния (ГКР, или surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS). От «обычной» рамановской спектроскопии ГКР отличается тем, что усиление комбинационного рассеяния молекул, адсорбированных на особых наноструктурированных поверхностях, позволяет обнаруживать даже единичные молекулы белков. Спектр комбинационного рассеивания поверхности металла, к которому прикреплены аптамер и репортер, определенным образом меняется при связывании вируса-вишени. Предел обнаружения — порядка 200 вирусных частиц на миллилитр, при этом получилось определить как «человеческие» штаммы H1N1, так и H3N2. С похожими пределами обнаружения детектируются штаммы птичьего вируса гриппа H5N1 и H7N2.

Исследователи также создали мультиплексный тест на ГКР-подложках с аптамерами, позволяющий в течение 15–17 минут выявлять разные респираторные вирусы (грипп А SARS-CoV-2, аденовирус, респираторно-синцитиальный вирус).

Четыре аптамера для выявления четырех вирусов: вверху слева — гриппа А, справа — коронавируса SARS-CoV-2, внизу слева — РСВ, справа — аденовируса. Credit: Int. J. Mol. Sci. 2023, DOI:   10.3390/ijms24098081

Еще один вариант — мультисенсоры на основе ОПТЭЗ (органических полевых транзисторов с электролитическим затвором, EGOFET-сенсоры) с аптамерами в качестве узнающих элементов. Те и другие сенсоры на несколько порядков превосходят по чувствительности экспресс-тесты на основе антител (тест-полоски). ПЦР-тесты сравнимы по чувствительности с ГКР-аптасенсорами, но требуют больше времени.

Эффективность аптамеров и моноклональных антител против ревматических заболеваний сравнил «квалифицированный заказчик» Максим Королев (НИИ клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ИЦиГ СО РАН).

Моноклональные антитела применяются для лечения этих заболеваний уже 25 лет, и их успехи бесспорны — это яркий пример того, как новая медицинская технология может изменить течение заболевания. Среди используемых в РФ моноклональных антител с большим отрывом лидирует риктусимаб. Главная его преимущество в том, что этот препарат вводится раз в полгода, отметил докладчик.

Но в то же время накопилось и множество проблем. В частности, существует группа пациентов, не отвечающих на терапию моноклональными антителами. Важные ограничения моноклональных антител — необходимость холодовой цепи при транспортировке, их собственная иммуногенность (которая может препятствовать использованию двух разных антител последовательно). Их производство достаточно сложное, что сразу стало ощущаться, когда вырос спрос на них во время коронавирусной пандемии.

Аптамеры не так иммуногенны и зависимы от холодовой цепи, как антитела, и производятся путем доступного и экономичного химического синтеза. Для их продукции не требуется иммунизация животных. Постепенно появляются зарегистрированные терапевтические препараты на основе аптамеров: Макуген от возрастной макулодистрофии, Изервей от географической атрофии сетчатки.

В Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН в 2020 году проверили экспериментально, могут ли аптамеры к интерлейкину-17А (IL-17A) или его рецептору подавить активность IL-17A; такая активность позволила бы разработать новые препараты против анкилозирующего спондилита (болезни Бехтерева). Работа выполнялась в сотрудничестве с НИИ клинической и экспериментальной лимфологии. Для проверки взяли уже запатентованные аптамеры к IL-17A и IL-17RA.

Оказалось, что подавление активности in vitro сравнимо с тем, что достигается с терапевтическим антителом (секукинумаб). Проверка in vivo, на мышах линии BALB/C с протеогликан-индуцированным спондилоартритом, подтвердила: подвижность животных увеличивается примерно в той же степени, что и при лечении диклофенаком.

Несколько докладов было посвящено существующим и потенциальным медицинским применениям РНК-интерференции. Александр Челкин (АО «ГенТерра») рассказал о том, как в компании производятся олигонуклеотиды, на примере люмасирана — активного компонента лекарства против редкого наследственного заболевания, первичной гипероксалурии 1 типа.

При этом заболевании в организме повышается концентрация оксалатов (солей щавелевой кислоты) из-за мутации в гене фермента AGXT, участвующего в метаболизме предшественника оксалата — глиоксилата. Когда фермент неактивен, глиоксилат накапливается и превращается в оксалат. Это приводит к образованию камней в почках и прогрессирующей почечной недостаточности в детском или молодом возрасте. Введение люмасирана подавляет продукцию другого фермента — гликолатоксидазы 1 (HAO1) — по механизму РНК-интерференции. Разрушение мРНК фермента снижает его продукцию и тем самым выработку глиоксалата, предотвращая его накопление и почечную патологию.

Люмасиран — двухцепочечная молекула РНК, содержащая химически модифицированные нуклеотиды. Модификации придают РНК стабильность во внутренней среде организма и облегчают проникновение через клеточную мембрану. Молекула РНК конъюгирована с тримером N-ацетилгалактозамина (GalNAc).

Компания «ГенТерра» выбрала люмасиран для демонстрации своих возможностей по производству олигонуклеотидов, поскольку это одобренный препарат с доказанной эффективностью. Кроме того, РНК, конъюгированные с GalNAc, — особенно перспективный класс препаратов, на рынке их становится все больше. GalNAc взаимодействует с рецептором ASGPR, который экспрессируют клетки печени, поэтому олигонуклеотид успешно доставляется в эти клетки.

Промышленная схема производства люмасирана начинается с синтеза носителя, на котором иммобилизован тример GalNAc (tri-GalNAc). Сам GalNAc тоже производится в «ГенТерре», что позволяет контролировать качество и положительно сказывается на цене продукта. Смысловая и антисмысловая цепи синтезируются отдельно, проходят очистку и концентрирование с помощью ультрафильтрации. Затем следуют отжиг дуплекса и лиофилизация. Система контроля качества на каждом этапе и валидация всех процессов обеспечивают воспроизводимый результат, подчеркнул докладчик.

Среди особенностей синтеза олигонуклеотидов — цикличность процесса (число циклов соответствует числу нуклеотидных звеньев) и тот факт, что главной примесью становятся побочные продукты — олигонуклеотиды, отличающиеся на одно-два звена от целевого продукта или потерявшие атом серы. Эти примеси удаляют с помощью хроматографической очистки. Недопустимой примесью считаются даже сенс- и антисенс-цепи, не образовавшие дуплекс, от них тоже необходимо очищать продукт.

Разработанная в «ГенТерре» платформа дает возможность производить качественные олигонуклеотиды, конъюгированные с GalNAc, на территории РФ, как для исследовательских целей, так и для производства медицинских препаратов, дженериков либо оригинальных. Александр Челкин отметил, что масштабирование производства и контроль качества продукции — отдельные задачи, в решении которых компания готова помогать производителям. (Подробный рассказ о платформе «ГенТерры» на PCR.NEWS.)

Вера Шашковская (Центр нейронаук и реабилитации мозга им. В.Л.Зельмана, Сколтех) рассказала об исследовании подходов к терапии бокового амиотрофического склероза (БАС) и фиброза печени, основанных на РНК-интерференции. Она отметила, что олигонуклеотиды для этого исследования производились в «ГенТерре».

Малые интерферирующие РНК — это короткие двухцепочечные молекулы, обычно длиной 20–25 нуклеотидов, которые подавляют активность определенного гена. К препаратам этого типа относятся патисиран и вутисиран (наследственный транстиретиновый амилоидоз, первый из препаратов содержит липидные наночастицы с РНК, второй — конъюгат РНК- GalNAc), а также ряд других РНК, конъюгированных с GalNAc, — гивосиран (острая печеночная порфирия), люмасиран и недосиран (первичная гипероксалурия 1 типа), инклисиран (первичная гиперхолестеринемия)

Докладчица с коллегами изучали перспективы применения малых интерферирующих РНК и низкомолекулярных препаратов на моделях фиброза печени и бокового амиотрофического склероза (БАС).

В настоящее время не существует безопасной эффективной терапии фиброза печени. Российские ученые исследовали действие 4-метилумбеллиферона (4-Mu) и siHas2 (малая интерферирующая РНК к мРНК гиалуронсинтазы) на мышей с фиброзом печени. Как 4-Mu, так и siHas2 уменьшили количество коллагеновых волокон и снизили количество клеток, характерных для фиброза, также снизились уровни маркеров фиброза в крови.

В случае БАС исследователи сначала работали с клетками микроглии — резидентными макрофагами ЦНС. При БАС микроглия переходят из гомеостатического состояния М0 в патологический фенотип М1 и вырабатывают провоспалительные цитокины. Но существует также фенотип М2, который производит противовоспалительные цитокины и способствует регенерации тканей. В качестве мишени был выбран интерферон-регуляторный фактор 5 (IRF5). Его повышенная экспрессия способствует переходу микроглии из М0 в М1.

Исследователи оценили действие нокдауна гена IRF5 с помощью малой интерферирующей РНК на фенотипы микроглии в культуре. Затем вводили малую интерферирующую РНК с радиоактивной меткой в желудочки мозга мыши, чтобы посмотреть распределение препарата в организме, и убедились, что он преимущественно накапливается в головном мозге. Терапевтическое воздействие проверяли на трансгенной линии мышей FUS, моделирующей БАС. РНК в липидных наночастицах вводили в мозг раз в неделю шесть недель подряд. К сожалению, в выживаемости на длительных сроках отличий не было, но медиана выживаемости увеличилась. Таким образом, направление поляризации микроглии в сторону защитных фенотипов с помощью РНК-интерференции можно рассматривать как перспективный подход к терапии БАС.

О разработанных в России аналогах ДНК и РНК с модифицированными фосфатными группами, обладающих терапевтическими свойствами, рассказал Дмитрий Стеценко (лаборатория бионанотехнологии физического факультета НГУ).

У всех, кто занимается олигонуклеотидами, в этом году юбилей, отметил докладчик. В 1955 году, 70 лет назад, вышла статья А.М. Майкельсона и нобелевского лауреата Александера Тодда о синтезе динуклеотидов, и так была заложена основа для химического синтеза более протяженных олигонуклеотидов. В США и Евросоюзе одобрено более двадцати лекарств на основе олигонуклеотидов, они уже составляют заметную долю среди препаратов, одобряемых в последнее десятилетие. Тем не менее «пока мы еще в лаг-фазе», сказал Дмитрий Стеценко.

На рынке присутствуют несколько классов модифицированных олигонуклеотидов. Раньше всех появились тиофосфаты, затем фосфордиамидные морфолиновые олигомеры (ФМО) и другие. Примечательно, что тиофосфорамиды были разработаны в Москве, в лаборатории академика Александра Антоновича Краевского ИМБ РАН, однако клиническое применение нашли в США.

Докладчик с коллегами внесли собственный вклад в разработку аналогов ДНК и РНК: ими разработаны сульфонилфосфорамиды и фосфорилгуанидины. Все эти соединение содержат модифицированную фосфатную группу. Результаты их исследований представлены в десятках публикаций, включая  недавние.

Фосфорилгуанидины (ФГО) могут ингибировать экспрессию генов микобактерий внутри человеческих макрофагов, восстанавливать чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии за счет ингибирования генов резистентности. Мезилфосфорамиды продемонстрировали существенно большую устойчивость к деградации под воздействием ферментов, чем тиофосфаты. Антисмысловые олигонуклеотиды на основе мезил- и бузилфосфорамидов в экспериментах in vitro показали также повышенную эффективность.

В 2025 году вышла публикация международного консорциума лабораторий, в которой сравнивалась эффективность коррекции генетического дефекта, вызывающего Х-сцепленную агаммаглобулинемию (мутации в гене тирозинкиназы Брутона нарушают созревание В-лимфоцитов) с помощью различных классов олигонуклеотидов.

С фосфорилгуанидиновыми олигонуклеотидами работают и за рубежом, в том числе компания Wave Life Sciences. (Например, она испытывала ФГО на мышиной модели миодистрофии Дюшенна.) Wave получила известность благодаря своим достижениям в терапевтическом РНК-редактировании, и в этих работах также используются модифицированные олигонуклеотиды. Компания Ionis Pharmaceuticals, один из лидеров в разработке терапевтических РНК, использовала мезилфосфорамиды и называла их «новым поколением антисмысловых олигонуклеотидов».

Заключительный доклад Елены Черноловской (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН) был посвящен влиянию химических модификаций на активность терапевтических олигорибонуклеотидов.

Докладчица напомнила о преимуществах малых интерферирующих РНК (высокая специфичность, низкая токсичность, универсальная платформа синтеза, природоподобный механизм действия) и их недостатках (не проникают через клеточную мембрану, расщепляются нуклеазами, выводятся из кровотока почками).

Модфикации РНК решают проблему устойчивости к нуклеазам, улучшения распределения, повышения специфичности и обеспечения биологической активности. Для улучшения доставки нуклеиновой кислоты внутрь клеток также применяются биоконъюгаты.

Докладчица с коллегами использовали в качестве транспортного лиганда производное холестерина. Такой лиганд обеспечивает доставку РНК в печень и снижает накопление в почках после внутривенного введения. Они показали, что для обеспечения биологической активности крайне важны особенности присоединения лиганда; важен и линкер, и выбор 3’ или 5’конца (при доставке без носителя ясно преимущество 5’-лигирования).

Незащищенные связи в молекуле малой интерферирующей РНК снижают эффективность и длительность ингибирующего действия. Поэтому ОН-группу рибозы в 2’-положении заменяют на О-СН₃ или атом фтора. Добавление нуклеотидов с такими модификациями в последовательность РНК обеспечивает нуклеазоустойчивость. Авторы рассмотрели это на примере РНК-интерференции к интерлейкину-6. В экспериментах на мышах холестериновый конъюгат с модифицированными нуклеотидами снижал воспаление, отек и повреждение тканей легких, вызванное введением липополисахаридов.

Олигонуклеотиды нужно защищать не только от эндонуклеаз, но и от экзонуклеаз. Такую защиту могут обеспечить фосфотиатная или мезильная модификации. Тиофосфаты токсичны, отметила докладчица, кроме того, мезильные модификации обеспечивают большую стабильность в гомогенате печени мыши, чем тиофосфаты, in vivo они также действуют эффективнее и длительнее.

Существуют индукторы РНК-интерференции необычного строения, которые содержат «вилки» (неспаренные концевые участки) и неканонические пары. Также могут использоваться мультимерные (например, тримерные) интерферирующие РНК, а также супрамолекулярные комплексы, содержащие однонитевые разрывы. Преимущество супрамолекулярных комплексов в том, что они могут быть любой длины, и при этом их удобно синтезировать. Индукторы РНК-интерференции могут нести два лиганда (sisiRNA), например, холестерин и М2 пептид.

Не так давно открыт новый противоопухолевый агент — иммуностимулирующая РНК, которая существенно изменяет профиль генной экспрессии, активируя гены, вовлеченные в различные типы противоопухолевого иммунитета. Докладчица с коллегами исследовали, как влияют различные химические модификации на иммуностимулирующие и антипролиферативные свойства РНК. 

Информация о докладчиках

Елена Геннадиевна Завьялова, д.х.н., доцент кафедры. химии природных соединений химического факультета МГУ

Максим Александрович Королев, д.м.н., руководитель НИИ клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ИЦиГ СО РАН, главный внештатный ревматолог Новосибирской области

Александр Андреевич Челкин, заместитель генерального директора по научно-производственной деятельности АО «ГенТерра»

Вера Сергеевна Шашковская, м.н.с., Центр нейронаук и реабилитации мозга им. В.Л.Зельмана, Сколковский институт науки и технологий

Дмитрий Александрович Стеценко, к.х.н., заведующий лабораторией бионанотехнологии физического факультета НГУ

Елена Леонидовна Черноловская, д.б.н., г.н.с., Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Реклама. Рекламодатель АО "ГенТерра" ИНН 7728896265

Другие материалы с «Сириус.Биотех»-2025

Роман Иванов: «Хочется заниматься самыми передовыми технологиями»

Как произвести терапевтический олигонуклеотид? «ГенТерра» делится опытом