О редактировании рыб

Николай Мюге — руководитель проекта «Создание панели геномных маркеров высокой продуктивности и болезнеустойчивости как основа для геномной селекции и геномного редактирования при создании новых отечественных пород и линий семги, форели и карпа», который получил грант Минобрнауки в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019-2027 годы. Размер гранта — 318,5 млн рублей.

Николай, что чувствуют ученые, выигравшие такой грант?

Когда объявили конкурс, первая мысль была: ну, раз выделяют такие большие деньги на геномные технологии, ясно, кому они достанутся, и нам ничего не светит. Но когда появились формулировки лотов программы, я подумал, что это ровно то, о чем я рассказываю последние несколько лет на всех конференциях и лекциях по генетике рыб. У меня есть отдельный набор слайдов про такое понятие, как геномная селекция, про то, что генетические технологии — это не только популяционная структура каких-то рыб, но и возможность влезать в функциональную геномику, пытаться применять это на практике. Но у нас в России в аквакультуре этого нет вообще. Тогда мы решили, что не попробовать подать заявку на такой грант будет нечестно по отношению к самим себе. И в авральном режиме — буквально за две недели — заявка была написана и подана. В то, что мы получим, не верили до последнего.

Ситуация такая. У нас в стране есть форелевые хозяйства, на Баренцевом море выращивают семгу, при этом 100% посадочного материала — импортные. Каждый малек семги или почти каждый форели куплен на Западе. Я довольно много общаюсь со специалистами на рыбозаводах, и на вопрос: «Почему вы не используете российский посадочный материал?» — они отвечают про плохое качество, медленный рост, разнобой в сроках созревания, и что готовое взять проще, чем пытаться выращивать у себя. В 60–70-е годы за разведение семги активно взялись норвежцы, понимая, что природные запасы могут исчерпать очень легко. А нам это казалось баловством, поскольку семга и в реках есть. Тогда не было никакой геномики, норвежцы использовали обычную селекцию, но семга становилась все крупнее и росла быстрее. Последние 20 лет они вовсю используют геномные методы.

А у нас еще разводят карпа.

Да, карп — это наша традиционная аквакультура. В отличие от семги или форели, которые растут только в холодной воде, карпа можно и нужно выращивать и в южных регионах. Он более неприхотлив, менее привередлив к технологии выращивания, но растет гораздо медленнее на килограмм корма. В советское время были выведены породы, их пытаются поддерживать, но улучшить, повысить продуктивность, не получается, традиционная селекция себя исчерпала.

Карп. Credit: 123rf.com

Что все-таки понимают под геномной селекцией? Это селекция на основе знания генома?

Это модный термин, и его пришивают ко всему. Но вот в чем суть. При традиционной селекции отбирают наиболее крупных производителей, получают от них икру, мальков, которых нужно дорастить до товарного размера, из них опять отбирают и снова доращивают все потомство до товарного состояния. Идея геномной селекции на первых порах не упрощает, а может быть, даже усложняет процесс. В начале ты берешь очень генетически отличающиеся линии или породы рыб, получаешь от них гибридов. Гибриды первого поколения все одинаковые и тебе не интересны. Во втором поколении происходит менделевское расщепление и рекомбинация, и все признаки расходятся. Можно одновременно смотреть самые разные признаки: скорость роста, болезнеустойчивость, стрессоустойчивость. А потом ты берешь крайние варианты и проводишь GWAS — genome-wide association study. Для этого нужна приличная выборка. Обычно такие признаки, генетическую основу которых ты хочешь понять, полигенные, то есть кодируются большим числом генов, каждый ген вносит лишь небольшой вклад в формирование данного фенотипа.

То есть основной принцип геномной селекции основан на GWAS?

Да, GWAS — это необходимая часть геномной селекции, потому что в дальнейшем ты оцениваешь полигенные признаки как набор однонуклеотидных полиморфизмов (на генетическом жаргоне снипов) и пишешь в идеале некую формулу, где вес каждого снипа определяет вклад в формирование признака, который ты хочешь. А потом, когда ты уже занимаешься селекцией, — берешь у малька кусочек плавника, не повредив его самого, генотипируешь по набору конкретных снипов и вместо того, чтобы выращивать всех, сразу отбираешь особей, имеющих нужную комбинацию, и выращиваешь их. Тем самым по сравнению с обычной селекцией процесс ускоряется раза в три-четыре. Потому что ты селекцию производишь не на результате конечного выращивания до товарного размера, а на геномном паттерне малька. Это то, чем мы собираемся заниматься уже после завершения этого проекта.

Задача осложняется тем, что проект рассчитан на два с половиной года, а карп, форель и семга созревают в три-четыре года. Поэтому мы пошли немного другим путем. Во-первых, у наших коллег в Институте прудового хозяйства (ВНИИПРХ) созданы гибриды двух генетически далеких пород карпа. Гибрид первого поколения, F1, у них сейчас уже практически созрел, поэтому в следующем году, если все будут хорошо, они получат тот самый F2, на котором мы сможем посмотреть, как будут расщепляться признаки. Мы не сумеем дорастить их до большого размера, но за год скорость роста уже можно оценить.

А другой подход — чисто эволюционно-биологический. У нас есть несколько разных по происхождению пород форели и есть дикая радужная форель микижа. Можно отсеквенировать по десятку особей каждой породы и посмотреть, чем они отличаются от дикого типа. Может быть, мы сможем увидеть, какие признаки отбирали те, кто создавал эту породу, хотя они ничего не знали про геномы. Если отбирался какой-то набор снипов, то у пород эти сайты окажутся в гомозиготном состоянии, в этом участке генома будет «провал» по гетерозиготности. В эволюционной биологии это называется жестким свипом — от английского sweep, «подметать» — так как в результате отбора происходит выметание природного полиморфизма. Точно так же в природе мы можем увидеть участки генома, которые были под естественным отбором, а здесь мы переносим это на искусственный отбор. Мы не можем и не будем копировать импортную породу, но мы можем, набрав информацию, в дальнейшем использовать эти маркеры для геномной селекции.

Радужная форель. Credit: 123rf.com

Мы пытаемся понять функциональную геномику высокопродуктивных пород. Если мы секвенируем рыбу, то должны более-менее понимать, какие гены за что отвечают. Часто мы переписываем функции генов с человека, потому что у человека они известны лучше всего. Но у рыб зачастую всё по-другому. Например, мне звонят коллеги и говорят, что хотят изучать гормон пролактин колюшки. У меня сначала отвисла челюсть, а потом выяснилось, что это все безумно интересно. У млекопитающих пролактин нужен для лактации, но у рыб же нет лактации? Оказалось, у них пролактин выполняет совсем другую роль, это основной гормон осморегуляции. И благодаря ему морская колюшка адаптируется к пресной воде. Много всяких вещей, которые хочется понять, исследуя функциональную геномику рыб, и у нас сейчас есть такая возможность.

Одна из задач вашего проекта — разработать метод очищения популяции от груза слабовредных мутаций. Как это можно сделать?

Эта идея была сформулирована Костей Попадьиным, сейчас он сотрудник Университета имени Канта в Калининграде. Суть вот в чем. У всех нас накапливаются слабовредные мутации. Мы с этим ничего не можем сделать, отбор у нас закончился, и мы тупо идем на дно, нагружая себя из поколения в поколение этими слабовредными мутациями. В инбредных стадах, например, карпа они также накапливаются, притом что там тоже отбора особенного нет, рыб кормят, им конкурировать не надо. Слабовредная мутация — это, например, если поменялась аминокислота в белке, но не настолько, чтобы белок стал нефункциональным, просто конформация немного испортилась. За счет чего происходит поддержание функции этого белка? За счет того, что есть белки-шапероны, в том числе белки теплового шока, которые помогают держать другие белки в правильно свернутом состоянии. Поэтому слабовредные мутации не проявляются, организм живет и живет. Белки теплового шока — это своеобразная заплатка на дырку в геноме, подпорка такая. А если мы возьмем стадо карпов и лишим его этой подпорки, выключив или ослабив работу белков теплового шока (данный подход мы называем «генетический гандикап»), то слабовредные мутации проявятся, и все рыбы, у которых этих мутаций много, подохнут. 

А как лишить? Ввести отбор?

Например, если мы поднимем температуру, то уже всем белкам будет плохо, и белков теплового шока будет не хватать, хотя их экспрессия увеличится. И с большей вероятностью те рыбы, которые несут больше дефектных белков, сдохнут первыми. Конечно, выжившие рыбы будут ослабленными, потому что пережили такой шок, у них эпигенетика будет у них плохая, но зато они избавятся от мутаций. Фактически это отсекающий отбор. Костя давно хотел эту идею применить, и когда появился грант, я сказал: давай попробуем. Не факт, что получится, но идея красивая. Он будет экспериментировать с разными типами отсекающего отбора на данио рерио, потому что у него геном меньше и с данио работать легче. И то, что лучше получится, мы попробуем применить на карпах. Один-два таких раунда, и можно немного поднять приспособленность. Есть теоретическая наука, которая говорит, что должно получится. А что скажет практика — увидим.

Теперь о том, что всех интересует больше всего. Как вы собираетесь редактировать рыб? Имеется в виду CRISPR?

В общем, да. Потому что всеми остальными способами очень трудно внести конкретную мутацию. Технология CRISPR/Cas очень многообещающая, и по-видимому, она будет неким мейнстримом в ближайшем будущем, но почему-то пока среди моих знакомых очень немного людей, совсем единицы, которые пробуют это делать. В основном на культурах клеток.

А в мире делают?

В мире делают, в тех больших организациях, которые занимаются геномной селекцией.

То есть на первом этапе вы определяете снипы, соответствующие хорошим потребительским качествам рыбы, а на втором этапе пытаетесь с помощью геномного редактирования эти снипы вставить в геном?

Если мы знаем, что они — маркеры хороших качеств, то можем вытащить их селекцией. А если не получается, можно попробовать редактировать. Но это надо отрабатывать. На карпе сразу это сделать трудно. У крупных рыб икринки огромные, с очень толстыми околояйцевыми оболочками, которые защищают икринку от внешних воздействий. Надо попасть микроманипулятором именно туда, куда надо, и дальше ты не знаешь, сработало это или нет. Ты смотришь, не появился ли у эмбриона мозаицизм, попала ли мутация в зародышевую линию. Затем надо вырастить этих рыб и попробовать понять, есть ли у них мутация. Потом надо получить следующее поколение и отобрать из него тех, кто наследовал редактированный элемент. Тогда будет ясно, что он уже в гермлайне, то есть навсегда. А в идеале — еще и свести его к гомозиготе.

Вы планируете это отрабатывать на колюшке и данио?

Да. И даже попробуем поколоть яйца карпа. Хотя по условиям контракта от нас хотели, чтобы мы написали «Лабораторный регламент геномного редактирования форели, семги и карпа»! Если даже мы скажем, что это сделали, нам ни один рецензент не поверит и правильно сделает, потому что мы не можем доказать, что это так. Поэтому мы пишем, что будем отрабатывать систему. Поскольку данио относительно близкий родственник карпа, мы можем сделать конструкцию для карпа, но вначале уколоть икринку данио, которая маленькая и проще для работы, и убедиться, что эта конструкция работает. Нужно подобрать гайдРНК, который соединяется с CRISPR/Cas, садится на ДНК и говорит, где рвать. Это тоже некое искусство, и нет строгих правил — как это должно быть. Можно даже сказать, это некое шаманство, близкое к искусству.

Будете делать попытки редактирования в эти два с половиной года?

На модельных рыбах — точно да. Почему я ввел колюшку — я ее хорошо знаю и люблю, и она хорошо изучена. И самые первые CRISPR-Cas, про которые я знаю по статьям, на рыбах были сделаны на колюшке. В мире есть несколько академических лабораторий, которые работают на данио и колюшке. А про коммерческие, которые работают на аквакультуре, мы мало, что знаем, потому что они все очень закрытые. Понятно, что работа идет, но это огромный бизнес. Там огромные деньги крутятся, как в фармацевтике. Селекция посадочного материала семги и форели — это очень похоже на селекцию бройлеров. Год или два назад огромные компании, которые производили рыб и кур, — они просто объединились. Потому что, в отличие от коров, свиней и т.д., курица дает много яиц в течение жизни, как и рыба. Технологии практически одинаковые и достаточно серьезные.

Если удастся поставить редактирование рыб на поток, будет ли спрос на такую рыбу? При том, насколько у нас в стране люди боятся ГМО. Хотя в России получается какой-то парадокс: при такой упорной борьбе с ГМО вдруг появляется поддержка геномных технологий, которая идет с самого верха, и геномному редактированию дают зеленую улицу.

Геномное редактирование — это другая история. В отличие от генной модификации, когда в один организм вставляют ген другого организма, причем с целой конструкцией, плазмидной или иной, геномное редактирование — просто замена одной буквы на другую, которая и так могла бы поменяться. Это его родной ген, мы ничего большого не вставляем, меняем только одну букву.

Кроме того, фишка вот в чем. Почему у нас ГМО запрещено законодательно? Не только потому, что люди боятся. Для сравнения, весь Казахстан засеян ГМО-пшеницей, ГМО-хлопком. А у нас запрещено. Дело в том, что наука, которая научилась это делать, достаточно сильно монополизирована, и у нас ее практически нет. Если бы у нас были свои ГМО-сорта, наверняка бы их разрешили, потому что продуктивность их сильно выше. Но у нас не хотят подсаживаться на монсантовские семена. Как я понимаю, общеполитическое видение такое: если мы получим сильную науку, которая умеет менять что угодно на что угодно, то сможем быть в этом независимыми. Такое импортозамещение важно. Но прежде всего нужно иметь опыт людей, которые умеют это делать. Это очень правильный подход, и ясно, что за этим будущее. Европа идет по осторожному пути, они пытаются развивать геномное редактирование, но, если я не ошибаюсь, оно у них попадает в категорию ГМО и не приветствуется. Американцы, китайцы, весь остальной мир активно это используют, главным образом на растениях, и у них ты не обязан генно-редактированный продукт маркировать как ГМО-продукт. У нас, по-видимому, к этому все идет, потому что пока это некая юридическая дыра, пока ничего генно-редактированного у нас нет. Но если научный потенциал будет достаточно высок, чтобы внедрять это в практику, я уверен, что это будет востребовано.

Конечно, наш проект больше научный, чем коммерческий, потому что за два года мы ничего толком не успеем. Но нам важно заложить основу, и мы надеемся, что нашу работу подхватят коллеги и ей заинтересуются индустриальные партнеры, которые будут готовы у себя все это выводить, потому что для этого нужны огромные индустриальные площади и т.д.

А у вас есть индустриальные партнеры?

Формально по структуре гранта их нет, но есть несколько крупных компаний, производителей семги и форели, которые уже давно к нам ходят и говорят, что хотели бы сотрудничать. Запрос есть. Но для этого требуются довольно большие деньги. Когда мы говорим, сколько стоит секвенирование, они немного «выпадают в осадок», притом что гарантированного результата и прибыли в ближайшее время это не принесет, выведение новых пород — достаточно долгая история. И вот теперь у нас есть грант, эти деньги от Минобра, 318 миллионов, которые, возможно, позволят это сделать. И конечно, я очень надеюсь, что то, что мы сейчас начнем делать, со временем вырастет в большие селекционные проекты.