17.12.2020

Новые наборы NEB для выделения ДНК дают фрагменты длиной до миллиона пар оснований

SkyGen

Компания SkyGen — поставщик лабораторного оборудования, реагентов и химреактивов для научно-исследовательских центров и лабораторий.

Доставляет необходимые материалы и оборудование для экспериментов в области NGS, CRISPR-CAS, ПЦР и выделения нуклеиновых кислот от мировых life science брендов с 2012 года. За десять лет клиентами SkyGen стали три тысячи научных лабораторий, НИИ и геномных центров в России и странах СНГ.

В каталоге компании SkyGen появились наборы для выделения ДНК «Monarch® HMW DNA Extraction Kit» от компании New England Biolabs. Высокомолекулярные фрагменты ДНК, выделенные на стеклянных бусинах, пригодны для получения длинных ридов с помощью платформы Oxford Nanopore Technologies.

В последнее время набирает популярность секвенирование третьего поколения — нанопоровые технологии, позволяющие получать длинные риды за относительно короткое время. Лидер на рынке нанопорового секвенирования — компания Oxford Nanopore Technologies. Длинные риды требуют длинных фрагментов ДНК, а значит, нужен особый подход к ее экстракции.

Высокомолекулярную ДНК можно получить с помощью классической фенол-хлороформной экстракции. Это трудоемкая многостадийная методика, кроме того, фенол и хлороформ — токсичные растворители, поэтому лаборатории уходят от нее, обращаясь к более простым и быстрым решениям. К таковым относятся осаждение ДНК с помощью спиртов или высококонцентрированных солевых растворов, выделение ДНК на магнитных частицах или спин-колонках с силикатной мембраной. Основной минус этих решений с точки зрения нанопорового секвенирования — невозможность получить фрагменты ДНК длиннее 200 килобаз.

В ответ на новые запросы рынка производители разрабатывают киты для получения именно высокомолекулярной ДНК. Так, компания New England Biolabs разработала технологию «Monarch® HMW DNA Extraction Kit», основанную на использовании крупных стеклянных бусин для осаждения ДНК из раствора. Решение представлено на рынке двумя наборами реагентов: для работы с культурами клеток и образцами крови и для экстракции ДНК из бактерий и образцов тканей.

Рисунок 1. Наборы NEB «Monarch® HMW DNA Extraction Kit» для экстракции высокомолекулярной ДНК.

Новые наборы NEB имеют ряд преимуществ перед другими китами для экстракции ДНК. Первое и главное — с их помощью можно получать фрагменты ДНК длиной до 1 мегабазы. Наборы хорошо работают с образцами самого разного происхождения: культурами клеток, тканями млекопитающих, насекомых и амфибий, а также с бактериями и образцами крови. Для экстракции можно использовать как свежие, так и замороженные образцы. Высокое качество полученной ДНК подтверждено спектрофотометрическим анализом (А_260/280=1,80–1.90). Индекс целостности DIN составляет около 9,8, то есть молекула практически интактная (рисунки 4, 5, 6). Содержание РНК в конечном растворе не превышает 1%.

Стоит отметить и скорость экстракции: она занимает от 30 до 90 минут в зависимости от типа образца, при этом наборы NEB работают с обычным лабораторным оборудованием.

Рисунок 2. Стеклянные бусины из набора «Monarch® HMW DNA Extraction Kit».

Выделение высокомолекулярной ДНК с помощью «Monarch® HMW DNA Extraction Kit» имеет принципиальное сходство с экстракцией на спин-колонках или магнитном сорбенте. Исследуемый образец проходит четыре основных стадии: лизис для высвобождения ДНК из клеток, связывание ДНК с сорбентом, отмывка ДНК на сорбенте и ее элюция. При этом есть существенные отличия.

Во-первых, технология набор «Monarch® HMW DNA Extraction Kit» предполагает двухэтапный лизис. Сначала разрушается только клеточная мембрана, ядра при этом остаются целыми. Благодаря этому с максимальной эффективностью работает включенная в набор РНКаза А, уничтожая цитоплазматическую РНК. На втором этапе разрушаются ядерные мембраны, и геномная ДНК выходит в раствор, что значительно повышает его вязкость. Для улучшения качества конечного продукта при выделении ДНК из образцов крови дополнительно проводится лизис эритроцитов; образцы тканей требуют процедуры гомогенизации и отделения белков.

Во-вторых, использование стеклянных бусин в качестве сорбента позволяет преодолеть ограничения других методов. Перешедшая в раствор геномная ДНК наматывается на химически инертные бусины, которые, в отличие от магнитных частиц, не рвут ДНК. Кроме того, итоговое количество ДНК не ограничивается емкостью сорбента — это отличает метод от экстракции на колонках с заданной вместимостью мембраны (см. рисунок 7).

Рисунок 3. Схема экстракции высокомолекулярной ДНК с помощью наборов NEB.

В-третьих, пользователь может регулировать длину фрагментов ДНК, изменяя скорость центрифугирования на этапе лизиса. Высокие скорости (2 000 об/мин) позволяют выделять молекулы ДНК размером 50–250 килобаз, низкие (300 об/мин) увеличивают длину фрагментов до 1 мегабазы. Производитель утверждает, что из всех представленных на рынке наборов только «Monarch® HMW DNA Extraction Kit» позволяют выделять ДНК такой длины из образцов крови. Это повышает качество секвенирования: показатель N50 возрастает на 4–8 килобаз.

Рисунок 4. Пульс-электрофорез (1% агарозный гель, 6 V/cm, 13С, 20 часов время импульса 0,5–94 сек, BioRad® CHEF-DR® III System) образцов высокомолекулярной ДНК (500 нг), выделенных с помощью «Monarch® HMW DNA Extraction Kit» HEK293 (1х10⁶) и крови человека (500 мкл). М — маркер Lambda длин ДНК для пульс-электрофореза. Скорость центрифугирования указана над снимками геля. Выход продукта, индекс целостности и чистота ДНК указаны в таблице под снимками.

Рисунок 5. Пульс-электрофорез (1% агарозный гель, 6 V/cm, 13С, 20 часов время импульса 0,5–94 сек, BioRad® CHEF-DR® III System) образцов высокомолекулярной ДНК (500 нг), выделенных с помощью «Monarch® HMW DNA Extraction Kit» из 10 мг замороженной почки крысы, 10 мг печени мыши, 20 мг замороженного мозга мыши, 20 мг мышцы мыши, 2×10⁹ клеток E. coli, 10 мг замороженных клеток B. cereus, 4 мг X. laevis, 3,8×10⁸ клеток S. cerevisiae, 15 мг A. aegypti. М – маркер Lambda длин ДНК для пульс-электрофореза. Скорость центрифугирования на этапе лизиса 2 000 об/мин. Выход продукта и чистота каждого образца указаны в таблице под снимком.

Рисунок 6. Пульс-электрофорез (в 1% агарозном геле, 6 V/cm, 13С, 20 часов время импульса 0,5–94 сек, BioRad® CHEF-DR® III System) образцов высокомолекулярной ДНК (300 нг рис. 6А, 500 нг рис. 6B), выделенных с помощью «Monarch® HMW DNA Extraction Kit» из разных источников: 10 мг почки мыши (рис. 6А), 1×10⁹ клеток E. coli (рис. 6B). М — маркер Lambda длин ДНК для пульс-электрофореза. Скорость центрифугирования на этапе лизиса 2 000 об/мин. Выход продукта, индекс целостности и чистота каждого образца указаны в таблице под снимками.

Рисунок 7. Линейная зависимость выхода ДНК от объема исходного образца клеток и крови. Измерения проводились для образцов ДНК из культур клеток HEK293 и крови человека, полученной от разных доноров. Были приготовлены пять разведений исходных образцов, выделение проводили по протоколам «Monarch® HMW DNA Extraction Kit», скорость центрифугирования на этапе лизиса составила 2 000 об/мин.

ДНК, выделенная с помощью наборов NEB, пригодна к секвенированию с помощью приборов Oxford Nanopore Technologies. На рисунке 8 приведены результаты секвенирования ДНК из клеток HEK293, человеческой крови и почки мыши.

Рисунок 8. ДНК выделяли по протоколам «Monarch® HMW DNA Extraction Kit» для культур клеток и незамороженной крови млекопитающих, без дальнейшего выбора размера фрагментов. Образцы почки мыши гомогенизировали с помощью роторно-статорного гомогенизатора. Библиотеки были подготовлены по протоколу Ligation Sequencing kit 1D (Oxford Nanopore Technology, арт. SQK-LSK109). Секвенирование проводили на платформе GridION, в проточной ячейке R.9.4.1(арт. FLO-MIN106D), до 48 часов. Длина прочтений указана в п. о., если не указано иное.

Киты «Monarch® HMW DNA Extraction Kit» от компании NEB делают выделение длинных фрагментов ДНК из образцов самого разного происхождения быстрым, удобным и эффективным. Наборы включают необходимые ферменты: РНКазу А и протеиназу К. Пестики для для гомогенизации образцов в микропробирках также входят в набор. При необходимости компоненты можно приобрести по отдельности. В таблице приведены продукты NEВ для очистки высокомолекулярной ДНК, включенные в каталог компании SkyGen.

Артикул	Наименование
T3050 S	Набор для выделения высокомолекулярной ДНК из образцов клеток и крови "Monarch® HMW DNA Extraction Kit" (5 реакций)
T3050 L	Набор для выделения высокомолекулярной ДНК из образцов клеток и крови "Monarch® HMW DNA Extraction Kit" (50 реакций)
T3060 S	Набор для выделения высокомолекулярной ДНК из образцов ткани "Monarch® HMW DNA Extraction Kit" (5 реакций)
T3060 L	Набор для выделения высокомолекулярной ДНК из образцов ткани "Monarch® HMW DNA Extraction Kit" (50 реакций)