Бактериофаги, заражающие синегнойную палочку, модифицировали для клинического применения

Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) — патогенная бактерия, вызывающая опасные инфекции, особенно у больных муковисцидозом. Быстро распространяющаяся антибиотикорезистентность затронула и эту бактерию, поэтому все более актуальной становится фаговая терапия. Однако этот вид терапии сопряжен с определенными ограничениями. Так, фаги обычно имеют узкий круг хозяев, у бактерий есть свои защитные системы, и даже чувствительные бактерии со временем развивают резистентность. Ответом могут стать генетически модифицированные фаги.

Ученые из Северно-Западного университета (США) получили клинически релевантные хвостатые фаги, поражающие различные штаммы P. aeruginosa. Методы синтетической биологии позволяют конструировать новые фаговые геномы и загружать их в вирусные частицы. Результаты исследования представлены в журнале Microbiology Spectrum.

Процесс создания фага включает два этапа: сборку синтетического генома и его загрузку в вирусные частицы. В качестве платформы для конструирования бактериальных и вирусных геномов часто используют пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae). В клетках дрожжей можно клонировать или конструировать фаговые геномы, меняя специфичность хвостов соответствующих вирусных частиц. Недавно с помощью этого метода был получен фаг vB_PaeP_PE3, инфицирующий ряд бактерий рода Pseudomonas, но не клинически значимые штаммы. Авторы новой работы использовали литический фаг JG024, заражающий многие клинически значимые штаммы P. aeruginosa.

Ученые секвенировали геном JG024, имеющийся у них в лаборатории, и показали, что для генома этого фага характерна круговая пермутация. Дело в том, что упаковка ДНК вируса в капсид начинается со связывания вирусного белка со специальным сайтом в вирусном геноме, однако терминаза, завершающая процесс упаковки, имеет низкую специфичность, из-за чего в капсид попадает от 98% до 110% референсного генома фага. Дополнительные эксперименты также подтвердили круговую пермутацию генома JG024. Нечувствительность генома JG024 к некоторым рестриктазам показала, что он метилирован.

В дрожжевых клетках можно изменять геном фагов, но нельзя упаковывать вирусную ДНК в фаговые частицы со сменой специфичности — для этого нужны бактериальные клетки, например, синегнойной палочки PA14. Ученые разработали протокол, позволяющий повысить эффективность трансформации бактериальных клеток и упаковки вирусной ДНК. Хлороформ часто используют при наработке фагов для уничтожения накопительных бактериальных клеток. Фаговый лизат JG024 обрабатывали хлороформом перед заражением PA14. Однако фаговые титры после обработки значительно понизились, что говорит о чувствительности фага к хлороформу.

Тогда ученые ввели геномную ДНК JG024 в количестве 25 или 100 нг с помощью электропорации в электрокомпетентные клетки PA14, после чего инкубировали их три или 24 часа. Как и следовало ожидать, при более длительной инкубации количество новообразованных вирусных частиц было больше. В то же время попытка увеличить титр вируса за счет повышения количества ДНК вируса показала, что при введении 100 или 500 нг существенной разницы в титре нет. Увеличения вирусных титров можно также добиться заменой штамма PA14 на PAO1.

В качестве платформы для клонирования и конструирования фаговых геномов был выбран штамм S. cerevisiae VL6-48N. Сначала геномы JG024 с круговой пермутацией разрезали системой CRISPR-Cas9 в сайте, который в геноме JC024 встречается один раз. Далее между образовавшимся линейным геномом и ДНК, содержащей обязательные элементы искусственной дрожжевой хромосомы (YAC) — автономно-реплицирующуюся последовательность, центромеру (CEN), а также ауксотрофный маркер Trp — была проведена рекомбинация. Так были получены YAC, содержащие геномы JG024. Используя этот метод, авторы целиком собрали геном JG024 из перекрывающихся фрагментов, полученных с помощью ПЦР. Таким образом, YAC позволяют производить с JG024 различные манипуляции, в том числе нацеливать их на разные штаммы. В то же время в клетках E. coli попытка клонирования JG024 оказалась безуспешной.

Авторы также проанализировали, какие факторы могут ограничивать выход синтетических фаговых геномов из YAC. Среди них есть факторы, присущие самому фагу, такие как разная специфичность на молекулярном уровне, способность противодействовать противовирусным системам и другие. Защитные системы бактерий могут подавлять сборку фагов: например, система рестрикции-модификации P14 блокирует этот процесс полностью. Наконец, ученые подтвердили эффективность разработанного ими метода на двух других фагах.

Таким образом, авторы разработали метод получения новых хвостатых фагов для инфицирования клинически релевантных штаммов синегнойной палочки. В дальнейшем она позволит конструировать фаги с заданными характеристиками из отдельных элементов.

Клетки млекопитающих поглощают фаговые частицы, чтобы усилить рост и метаболизм