Белковую нанопору впервые синтезировали de novo

В настоящее время в нанопоровом секвенировании используются поры, полученные путем адаптации природных трансмембранных белков. Их свойства (например, заряд определенных участков или диаметр поры) сложно изменять желаемым образом. Японские ученые пошли другим путем и создали нанопору de novo.

В качестве желаемой вторичной структуры для белка-нанопоры была выбрана β-бочка, состоящая из мономеров, каждый из которых сворачивается в β-шпильку. Мономер состоит из 28 аминокислот и включает в себя трансмембранный участок β-листа, β-поворот и терминальные участки.

Трансмембранный участок β-листа составлен из чередующихся гидрофильных и гидрофобных аминокислот (серина и валина). Такое чередование приводит к тому, что остатки серина и остатки валина обращены в разные стороны и формируют внутреннюю и обращенную к мембране стороны β-листа, соответственно.

В качестве β-поворота была использована консервативная последовательность -DSDG-, поскольку она содержит отрицательно заряженные аминокислоты. На C- и N- концы при этом были добавлены положительно заряженные остатки RG- и -GR. Такая полярность мономера позволила контролировать сборку нанопоры с помощью тока. Кроме того, остатки тирозина были добавлены на предполагаемые границы липидной и водной фаз для стабилизации трансмембранного состояния.

Авторы пишут, что даже для них был неожиданностью, что такой простой de novo дизайн сразу привел к созданию стабильной нанопоры. Мономер из 28 аминокислот синтезировали химически. Оказалось, что он действительно формирует в мембране нанопоры от 1,7 до 6,3 нм в диаметре, содержащие от 7 до 18 мономерных единиц, соответственно.

Нанопора диаметром около 5,4 нм оказалась способной давать сигнал при пропускании двухцепочечной ДНК. Нанопора с диаметром 6,4 нм реагировала на прохождение ДНК со структурой G-квадруплекса и при этом не отвечала на другие формы ДНК.

Оказалось, что внедрения двух остатков глицина в середину трансмембранного участка достаточно, чтобы такой модифицированный мономер формировал нанопору определенного диаметра — 1,7 нм. Ученые показали принципиальную возможность использования этой нанопоры для секвенирования полипептидов, используя поли-L-лизин.

Авторы планируют продолжить создавать нанопоры с заданными свойствами, например, для секвенирования пептидов или использования в качестве молекулярных роботов.