«Белковый магнитофон» записывает события в клетке на протяжении нескольких недель

Экспрессия генов в клетке динамически управляется сетью из множества регуляторных компонентов. Изучать эти динамические процессы довольно трудно. Современные методы в основном или получают статичный «снимок», или отслеживают судьбу единичных компонентов во времени. Для изучения сети регуляции генов исследователи из США попытались создать метод, который мог бы записать взаимодействия множества компонентов, происходящие в одной клетке в течение довольно длительного времени (в течение дней и недель).

Ранее этой же группой исследователей была предложена концепция «белкового магнитофона», который позволяет записать процессы, происходящие в клетке, на линейный белковый комплекс (XRI- и iPAK4-системы). Длинный линейный белковый комплекс самостоятельно собирается из мономеров — структурных, сигнальных, иногда других. Сигнальные мономеры несут метку (тэг) и экспрессируются только под действием промотора того гена, о работе которого ученые хотят узнать. Однако предыдущие подходы не позволяли одновременно записывать сигналы в течение многих дней, так как рост линейного комплекса был ограничен размером клетки. В новой системе CytoTape используется гибкий, нитевидный, физиологически совместимый комплекс, который может вырасти больше клетки и содержать множество молекулярных тэгов. CytoTape обеспечивает одновременную масштабируемую запись активности пяти транскрипционных факторов — CREB, c-fos, Arc, Egr1 и Npas4 — в отдельных живых клетках.

Авторы поставили перед собой задачу — обеспечить запись большего числа событий в течение длительного времени. Для этого нужен более длинный белковый комплекс, на который «навешиваются» тэги. Но жесткий комплекс или искажает клеточную мембрану, что может повлиять на физиологию клетки, или перестает расти, достигнув определенного размера. Тогда они снизили его толщину за счет изменения состава мономеров и повысили гибкость, а затем изучили свойства комплекса в разных типах клеток, сравнив систему CytoTape с XRI и iPAK4.

В нейронах iPAK4 формировал жесткие кристаллические волокна, искажающие мембрану уже через три дня. XRI могли гнуться, но спустя семь дней становились все толще. Волокна CytoTape, напротив, оставались тонкими спустя 18 дней и сильно сгибались, как волосок, не влияя на морфологию клетки.

Чтобы протестировать систему CytoTape, исследователи экспрессировали сигнальный мономер с V5-тэгом под промотором гена Egr1, а также структурный мономер с HA-тэгом под промотором убиквитина C (UbC). Спустя 15 дней под влиянием KCl появились V5-пики на волокне CytoTape. В это время XRI-система уже не регистрировала сигнал.

CytoTape демонстрировала схожие результаты в клетках HEK и HeLa. А вот система XRI формировала толстые волокна в HEK и переплетенные структуры в HeLa. Система iPAK4 деформировала клетки. CytoTape не изменяла синаптическую передачу и динамику кальция культивируемых нейронов, а также жизнеспособность, пролиферацию, физиологическое состояние, транскрипционную активность или сигнальную активность клеток HEK. С помощью системы HaloTag, ранее используемой для iPAK4, можно вносить метки времени.

IEG — ключевой регулятор многих клеточных процессов. Исследователи протестировали, как CytoTape зафиксирует экспрессию IEG и зависимую от него экспрессию c-fos, Arc, Egr1 и Npas4, а также pCREB (активность CREB регулирует экспрессию IEG). Сигнальные мономеры с V5-тэгом экспрессировали в нейронах под действием IEG- или pCREB-зависимых промоторов. Клетки стимулировали KCl, чтобы индуцировать деполяризацию и активность IEG, или форсколином, чтобы индуцировать экспрессию CREB. CytoTape записала пики V5 в стимулированных нейронах. Более сильная и продолжительная стимуляция приводила к более высоким и крутым пикам V5, так что CytoTape фиксирует как время, так и амплитуду транскрипционных событий.

Система CytoTape работала в клетках в течение трех недель. Она могла детектировать несколько сигналов одновременно, например, c-fos-сигнальный мономер с тэгом V5 и Arc-сигнальный мономер с тэгом OLLAS. Оба сигнала регистрировались после стимуляции форсколином. Экспрессируя пять сигнальных мономеров под промоторами c-fos, Arc, Egr1, Npas4 и CREB, каждый со своим тэгом, авторы получили пять динамичных сигналов на одном волокне.

Авторы опробовали систему in vivo и показали, что она работает в мышином мозге. Однако в организме CytoTape формировала несколько волокон в одной клетке (в культуре — обычно одно или два). В этом случае флуоресцентная микроскопия может не справиться со считыванием сигналов. Исследователи модифицировали систему, чтобы на один нейрон приходилось одно волокно. При экспрессии CytoTape в гиппокампе работа этого участка мозга не нарушалась, что подтвердили поведенческие тесты.

Хранилище для транскриптома: как «записать» динамику экспрессии в клетке