Хранилище для транскриптома: как «записать» динамику экспрессии в клетке

Наблюдение за жизненным циклом клеток, в том числе последовательность молекулярных событий, может дать важную информацию о нормальном развитии и патологиях. Однако отслеживать динамику молекулярных процессов затруднительно: такие подходы, как секвенирование РНК, деструктивны и фиксируют только момент отбора образца. Прижизненная визуализация требует постоянного оптического контроля и ограничена количеством молекул, которые можно отследить. Авторы статьи в Science разработали генетически кодируемый инструмент, позволяющий «записывать» динамику транскрипции в живой клетке, чтобы потом извлечь и проанализировать эти данные. Система получила название TimeVault. 
За основу ученые взяли органеллу vault — эндогенный рибонуклеопротеиновый комплекс с неясной функцией, высококонсервативный среди эукариот. Они предположили, что полая самособирающаяся структура этого комплекса обеспечит хранение захваченных транскриптов. 

Vault состоит преимущественно из основного белка (main vault protein, MVP), который самоорганизуется в структуры в форме бочонка даже в отсутствие прочих нативных компонентов. Для захвата мРНК ученые использовали белок, связывающий поли(А)-хвосты (PABP), к которому присоединили домен другого компонента vault — поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (vPARP). Домен INT в составе vPARP отвечает за связывание с самой органеллой. 

Полученная синтетическая конструкция оказалась способна селективно захватывать цитозольные транскрипты — ученые подтвердили это на клетках HEK293T. Их трансфицировали плазмидами, кодирующими MVP, PABP-INT или оба этих белка; экспрессия конструктов была доксициклин-индуцируемой. Через два дня после индукции клетки лизировали и обрабатывали смесью РНКазы А и РНКазы Т1 — после этого в лизате оставались только РНК, захваченная частицами vault и защищенная от деградации. 

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR) показала, что при коэкспрессии MVP и PABP-INT, но не какого-то из этих белков отдельно, мРНК была защищена от деградации. Также исследователи оценили временное разрешение транскриптомного «снимка». В системе, где экспрессия TimeVault выключается доксициклином, захват РНК прекращался в течение 24 часов после его добавления. 

Для оценки стабильности РНК, упакованной в TimeVault, авторы инкубировали клеточные лизаты при 37 °C в течение 12 дней, а затем обрабатывали РНКазой для удаления незащищенных РНК. Сохранность транскриптов оценивали при помощи RT-qPCR гена ACTB. Спустя 8 дней инкубации в TimeVault оставалось около 68% от изначального количества транскрипта, а спустя 12 дней — 42%. В лизатах контрольных клеток мРНК ACTB быстро деградировала, и через четыре дня ее оставалось менее 7%, а через 12 она не детектировалась вовсе. 

Исследователи убедились, что TimeVault не оказывает значимого влияния на жизнеспособность клеток, проведя люциферазный тест CellTiter-Glo (он оценивает метаболическую активность клеток по уровню АТФ). Транскриптомный профиль также почти не отличался от исходного. Из 20 360 проанализированных генов экспрессия значимо изменилась только у двух — MVP и PABPC1 (то есть у компонентов самой системы TimeVault).

Однако насколько TimeVault справится со своей основной задачей? Чтобы это проверить, авторы проследили реакцию клеток на стресс — тепловой шок или гипоксию. Эти два варианта выбрали из-за хорошо охарактеризованного быстрого ответа на транскриптомном уровне. 

Для моделирования теплового шока клетки, экспрессирующие TimeVault, сначала культивировали при температуре 37 °C, после чего обрабатывали доксициклином для прекращения «записи». Затем их подвергали тепловому шоку (42 °C) в течение 6 часов перед сбором. Клеточные лизаты разделяли на две аликвоты: в одной анализировали транскриптом на момент сбора, другую обрабатывали РНКазами, чтобы выделить захваченные TimeVault транскрипты. Анализ дифференциальной экспрессии генов выявил в «записанном» транскриптоме значительное повышение уровня канонических генов ответа на тепловой шок, например, таких членов семейства HSP, как CRYAB и DNAJB1. Аналогичным образом ученые подтвердили способность TimeVault фиксировать прошлое состояние транскриптома в эксперименте с гипоксией. 

Наконец, исследователи применили TimeVault к биологически и клинически значимой системе — клеткам аденокарциномы легких, способным неодинаково отвечать на терапию. Клетки линии PC19 несут делецию 19-го экзона в гене рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), поэтому они чувствительны к ингибитору EGFR осимертинибу. Однако небольшая популяция (20-25%) клеток, как правило, остается персистировать в после обработки этим препаратом. 

Авторы записали транскриптом клеток до обработки осимертинибом и выявили 449 дифференциально экспрессируемых генов (однако после лечения разница для 232 пропадала). Ученые обнаружили, что интенсивность окислительного фосфорилирования в будущих персистентных клетках выше, чем в остальной популяции. Это согласуется с данными о том, что химиорезистентные опухолевые клетки используют его активнее, чем гликолиз. Кроме того, клетки, сохранившиеся в популяции после лечения, демонстрировали меньший пролиферативный потенциал. 

Ученые отобрали ряд предполагаемых маркеров (PI3, CXCL8, LCN2, AKR1C1 и FN1) и проанализировали их функциональный вклад с помощью фармакологических ингибиторов, если они были доступны, или нокаута этих генов. Опыты на культуре раковых клеток подтвердили роль перечисленных генов в персистентности при ингибировании EGFR. 

TimeVault — генетически кодируемая система записи транскриптома, которую можно «включать» и «выключать» в нужные моменты времени. Она позволяет с высокой точностью регистрировать транскриптом и минимально воздействует на естественные процессы, что делает ее перспективным инструментом для отслеживания экспрессионного профиля клетки в зависимости от условий. 

TransitID отслеживает перемещения белков в живых клетках и между ними