TransitID отслеживает перемещения белков в живых клетках и между ними

Белки, составляющие протеом человека, являются основой его жизнедеятельности. Их высокая динамичность и сложность взаимодействий делают изучение перемещений эндогенных белков между определенными органеллами и живыми клетками затруднительной задачей. Методики микроскопии и флуоресцентного мечения позволяют определить перемещения индивидуальных белков, но не их взаимодействия. В то же время возможность оценить передвижение белков могла бы пролить свет на молекулярные механизмы, используемые органеллами и клетками для коммуникации и взаимного регулирования.

Исследователи из Стэнфордского университета и коллабораторы придумали новую технологию TransitID (trafficking analysis by sequentially incorporated tags for identification, анализ перемещения посредством последовательного внедрения меток для идентификации), основанную на методе proximity labelling (PL). Суть методики PL заключается в мечении всех молекул вблизи определенного белка-«приманки». Белок генетически сливают с неспецифичным ферментом (применяются APEX2, BioID и TurboID), активация которого приводит к модификации молекул вблизи белка-«приманки»: TurboID делает это посредством связывания молекул с биотином, а APEX2 — посредством связывания с алкин-фенолом (модификация авторов статьи). В новой технологии выполняются две PL-реакции в тандеме в одном и том же биологическом образце. Сначала один из ферментов (TurboID) метит молекулы в источнике, спустя некоторое время с помощью второго фермента (APEX2) помечаются молекулы в точке назначения. В конце клетки лизируются, а белки и имеющиеся у них метки изучаются с помощью масс спектрометрии или вестерн-блоттинга. Если анализируемая молекула содержит метки от обоих ферментов, значит, она переместилась из источника в точку назначения.

Для тестирования новой технологии ученые разместили TurboID в цитозоле клеток, а APEX2 — в матриксе митохондрий, провели тандемную маркировку и проанализировали, какие белки были помечены только APEX2, а какие — обоими ферментами. Среди помеченных только APEX2 оказались митохондриальные белки, транслируемые с митохондриальной ДНК, а среди меченых обоими ферментами — с ядерной ДНК, что доказывало исправность и правильную работу технологии. С помощью TurboID ученым также удалось обнаружить ряд белков (148 белков), путь которых начинается не в цитозоле, а на наружной митохондриальной мембране.

Также авторы проанализировали изменения в перемещении белков из цитозоля в ядро при окислительном стрессе, индуцированном арсенитом натрия. Из 1791 белка, перемещаемого из цитозоля в ядро при нормальных условиях, были обнаружены 127, интенсивность переноса которых значительно уменьшилась. Кроме того, были определены белки (ERC1, POLR2D и ST13), которые в условиях стресса располагались в стресс-гранулах (SG).

Стресс-гранулы — это немембранные структуры, которые изолируют мРНК, застрявшие на этапе инициации трансляции. У SG есть много общих характеристик и компонентов с ядрышками. На следующем этапе исследователи применили методики для анализа перемещения молекул между ядрышками и SG. К удивлению авторов, было обнаружено, что в условиях стресса в SG перемещается транскрипционный фактор JUN (известно, что его уровни значительно повышаются при разных видах рака). Таким образом он избегает агрегации в ответ на окислительный стресс и защищается от утилизации клеткой.

Также с помощью TurboID ученые отследили белковые взаимодействия между макрофагами и опухолевыми клетками. Они идентифицировали ряд белков, которые перемещаются из цитозоля опухолевых клеток в цитозоль макрофагов и определили способ их перемещения. И наоборот, были выявлены цитокины, перемещающиеся из разных видов макрофагов (М1 и М2) в опухолевые клетки.

Таким образом, авторы создали новую эффективную методику для определения белковых популяций на основе компартмента или типа клеток. «Новая техника дает возможность сочетать сильные стороны микроскопической и масс-спектрометрической протеомики, при этом позволяя рассмотреть живые образцы с их динамическим движением и функционированием и объективно оценить все белки одновременно», — сказала Алиса Тинг, профессор генетики на медицинском факультете Стэнфордского университета и один из ведущих авторов статьи.

Высокоинтенсивные тренировки меняют протеом скелетных мышц