Чувствительность жидкостной биопсии повысили с помощью липидных наночастиц

Жидкостные биопсии, в том числе анализ внеклеточной ДНК в крови, могут использоваться для диагностики, мониторинга или молекулярного профилирования заболеваний. Зачастую для успешного клинического применения им недостает чувствительности. В онкологии разработки, направленные на повышение чувствительности обнаружения циркулирующей опухолевой ДНК (цоДНК), в основном связаны с методами секвенирования и анализа ex vivo. Однако проблема малых количеств самой цоДНК in vivo по-прежнему стоит остро. Возможное решение предложили американские ученые, опубликовавшие работу в Science.

Авторы статьи предположили, что повысить уровень циркулирующей опухолевой ДНК в образцах крови можно, временно снизив ее клиренс in vivo. Выведение циркулирующей ДНК из крови обеспечивают два механизма — поглощение резидентными макрофагами печени и деградация циркулирующими нуклеазами. Чтобы вмешаться в первый из механизмов, исследователи воспользовались липидными наночастицами. Большая часть внеклеточной ДНК циркулирует в виде мононуклеосом, и ученые предположили, что ее поглощение можно снизить при помощи конкурирующих частиц, например липосом, которые будут фагоцитироваться макрофагами печени. Чтобы это проверить, они оценили поглощение флуоресцентно-меченых мононуклеосом in vitro. В клеточной модели липосомы существенно ингибировали поглощение мононуклеосом макрофагами, при этом не снижали выживаемость макрофагов и не препятствовали фагоцитозу более крупных частиц, например, инактивированных клеток E. coli.

Затем исследователи проверили, будет ли такой эффект наблюдаться in vivo. Они вводили липосомы в кровь мышам, после чего инъецировали мононуклеосомы, содержащие конкретный фрагмент ДНК. Оказалось, что липосомы поддерживали концентрацию целевой ДНК на более высоком уровне, причем эффект был дозозависимым. Также липосомы увеличивали концентрацию эндогенной внеклеточной ДНК в плазме крови, причем пик концентрации достигался через 30 минут после введения дозы 100 мг/кг (10,3-кратное увеличение по сравнению с PBS) или через 3 часа после введения дозы 300 мг/кг (78-кратное увеличение по сравнению с PBS). При этом эффект был временным — концентрации возвращались к исходному уровню через 5 часов после введения липосом в меньшей дозе и через 24 часа — в большей. Сами липосомы быстро накапливались в тканевых макрофагах.

Другой способ предовратить снижение концентрации внеклеточной ДНК — это связывание мононуклеосом антителами, которые препятствовали бы узнаванию ДНК нуклеазами. Авторы выбрали моноклональное антитело 35I9 (изотип IgG2a), полученное от предрасположенной к волчанке мыши. In vitro это антитело связывалось с двуцепочечной ДНК, в том числе в составе нуклеосомы, и предотвращало ее расщепление нуклеазами.

Чтобы изучить активность этих моноклональных антител in vivo, авторы вводили мышам мононуклеосомы с целевым фрагментом ДНК, а также инъецировали 35I9 либо контрольное антитело изотипа IgG2a. Антитела замедляли выведение мононуклеосом, однако абсолютное количество целевой ДНК было одинаковым в случае 35I9 и контрольного антитела. Ученые предположили, что это связано с выведением самого антитела при участии Fc-рецептора. Модифицированное антитело aST3, у которого было нарушено связывание с Fc-рецептором, поддерживало концентрацию целевой ДНК на более высоком уровне, чем 35I9. Таким образом, защитить внеклеточную ДНК от быстрого выведения из плазмы крови можно и с помощью моноклональных антител.

Наконец, авторы работы проверили, способны ли антитела и липосомы обеспечить более чувствительную детекцию опухолевой ДНК в плазме крови. Они отслеживали 1822 опухоль-специфичных однонуклеотидных вариаций во внеклеточной ДНК. Мышам с метастазами в легких вводили липосомы в дозе 100 мг/кг и через час после инъекции отбирали образцы плазмы крови. Такой анализ проводили раз в неделю на разных стадиях прогрессии опухоли. Исследование показало, что введение липосом увеличивало концентрацию внеклеточной ДНК в плазме в 7, 14 и 28 раз на первой, второй и третьей неделе, соответственно. Оно также повышало количество детектируемой опухолевой ДНК в 4, 19 и 60 раз. Это повышение, в свою очередь, сказывалось на эффективности анализа внеклеточной ДНК.

Ученые сравнили чувствительность выявления опухоли по внеклеточной ДНК при введении липосом и без них. Они классифицировали каждый образец плазмы как положительный, если количество обнаруженных однонуклеотидных вариаций превышало заданный порог (от 2 до 10 в зависимости от строгости теста). Оказалось, что липосомы повысили чувствительность теста, причем наиболее сильно это проявлялось при низкой опухолевой нагрузке. В этом случае рак не выявлялся стандартным способом, но 75% образцов были классифицированы как положительные у тех мышей, которым вводили липосомы. Иными словами, липидные наночастицы позволили выявлять опухоли меньшего размера в доклинической модели, причем их введение не сказывалось на прогрессии опухоли и не вызывало токсических эффектов.

Аналогичным образом авторы работы проверили, улучшат ли антитела чувствительность тестов. Введение aST3 повышало концентрацию опухолевой ДНК в плазме крови по сравнению с изотипическим контролем, причем эффект зависел от дозы вводимого антитела (максимальная разница достигалась при введении 4 мг/кг антитела и была 19-кратной). Чувствительность анализа внеклеточной ДНК также повышалась при введении aST3: эти антитела обеспечивали ту же чувствительность, что и изотипический контроль, при содержании опухолевой ДНК в 10 раз ниже, чем в контроле.

Таким образом, повысить чувствительность детекции опухоли по цоДНК можно, временно замедлив выведение внеклеточной ДНК из плазмы крови. Добиться этого позволяет введение в кровоток липидных наночастиц, конкурирующих с внеклеточной ДНК за поглощение макрофагами, или ДНК-связывающих антител.



Наночастицы активируют STING в «холодных» опухолях