Как бактерии адаптируются к новому хозяину после трансплантации фекальной микробиоты

Трансплантация фекальной микробиоты (ТФМ) от здорового донора уже нашла применение в клинике, в частности, при трудноизлечимых инфекциях Clostridioides difficile. Однако ее успех зависит от того, какие именно бактериальные штаммы приживаются в кишечнике реципиента. Однако до недавнего времени ученые не могли с необходимой точностью отслеживать судьбу отдельных штаммов, особенно если в образце присутствуют сходные штаммы.

Существует три основных подхода к анализу микробиома: классическое культивирование с последующим секвенированием отдельных изолятов, а также прямое секвенирование микробиома без предварительного культивирования — как с использованием коротких прочтений (Illumina и др.), так и длинных прочтений, полученных с использованием технологий Oxford Nanopore и PacBio.

Для отслеживания бактериальных штаммов после ТФМ ученые из Соединенных Штатов и Австралии разработали метод LongTrack, который использует метагеномику длинных прочтений. Он преодолевает ограничения традиционного секвенирования коротких прочтений и позволяет оценить, как донорские штаммы адаптируются к новому хозяину.

LongTrack обеспечивает сборку высокочистых геномов из длинных прочтений (полученные таким образом геномы называют MAG — Metagenome-Assembled Genomes). Длинные прочтения по сравнению с короткими существенно облегчают de novo сборку полных геномов с разрешением до уровня штамма, обеспечивая значительно более низкий уровень контаминации и более высокое качество сборки.

Чтобы отслеживать штаммы с помощью секвенирования, сначала собирают геномы изолятов, полученных от донора и реципиента, и выбирают в них уникальные k-меры — короткие участки ДНК, которые будут служить маркерами штаммов при оценке их разнообразия и количества в образцах реципиента после ТФМ. Ранее авторы проводили подобные исследования с помощью секвенирования коротких прочтений.

Ключевое методологическое новшество LongTrack — усовершенствованный подход к отбору k-меров. Для схожих сосуществующих штаммов уникальные k-меры выбирают только из общих геномных регионов, секвенированных у всех штаммов. Эта адаптация необходима для обеспечения надежности, поскольку для штаммов с низкой численностью длинные прочтения могут дать неполные MAG. При выборе k-мера из участка, который был секвенирован у одного штамма, но не у другого, в повторных анализах могут быть ложные срабатывания, если этот участок окажется неуникальным. LongTrack свободен от этого недостатка.

Валидация метода, проведенная на основе данных с культивированными изолятами (использованными как «эталон»), показала, что LongTrack достигает 100%-ных точности и специфичности. Предыдущий подход, использующий короткие прочтения, продемонстрировал более низкую точность и значительно меньшую специфичность.

Авторы применили LongTrack к шести пациентам, получившим ТФМ: четверо для лечения рецидивирующей инфекции Clostridioides difficile (rCDI), и двое для лечения воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) Ученые обнаружили в общей сложности 648 прижившихся штаммов. При этом, например, у пациентов с rCDI 396 MAG не были обнаружены в более ранних исследованиях, основанных на культуральном методе.

Анализ показал стабильное и долгосрочное приживление донорских штаммов в кишечнике реципиентов с rCDI. Средняя пропорциональная приживаемость составляла около 98% в первую неделю и сохранялась на уровне 63% даже спустя пять лет после процедуры.

Среди прижившихся штаммов были идентифицированы важные для здоровья человека виды, такие как Akkermansia muciniphila (связан с модуляцией кишечной микробиоты и улучшением исходов лечения) и Faecalibacterium prausnitzii (связан с производством короткоцепочечных жирных кислот и предотвращением воспаления).

У пациентов с ВЗК микробиомы изначально более сложны. В этих случаях приживаемость донорских штаммов была ниже, чем при клостридиальных инфекциях (35-64%), а устойчивость исходных штаммов реципиента — выше (80-96%). Это соответствует предположению о большей резистентности и разнообразии микробиома пациентов с ВЗК.

Одним из самых значимых результатов стало обнаружение геномных изменений, которые происходят в прижившихся штаммах по мере их адаптации в новом организме. Длинные прочтения, в отличие от коротких, позволяют обнаруживать сложные структурные вариации (SV), такие как инверсии, делеции и вставки.

За пять лет наблюдения исследователи идентифицировали 38 структурных вариаций в прижившихся штаммах. Многие SV находились в генах, связанных с адаптацией. Например, были выявлены делеции в генах TonB-зависимых рецепторов, которые играют ключевую роль в транспорте железа. Эти делеции могут быть связаны с селективным давлением иммунной системы нового хозяина. Также была замечена инверсия в гене susC у Bacteroides stercoris, частота которой резко возрастала в наиболее поздних образцах, взятых после ТФМ.

Еще одно преимущество длинных прочтений, которое использовал LongTrack, — возможность одновременно обнаружить SV и профили ДНК-метилирования на уровне одной молекулы. Так впервые удалось связать геномные перестройки с изменениями в эпигеноме. Например, у штамма Parabacteroides merdae была обнаружена сложная инверсия, затрагивающая S-субъединицу системы рестрикции-модификации (RMS). Она вызывала переключение между шестью различными генотипами, отличающимися ориентацией фрагментов. Примечательно, что генотип 6 отсутствовал у донора, но значительно увеличил свою частоту после ТФМ.

S-субъединица влияет на распознавание мотивов ДНК метилтрансферазами, следовательно, такие перестройки способны изменять паттерны метилирования генома. И действительно, новый генотип 6 коррелирует с появлением мотива метилирования ДНК (CA6mAYNNNNNNRTC), который не был замечен ранее. Влияние структурных вариаций на метилирование может способствовать адаптации бактерий к новой кишечной среде.

Таким образом, разработка LongTrack устанавливает новый стандарт для высокоточного отслеживания микробных штаммов. Это может быть полезно для конструирования терапевтических консорциумов, состоящих из точно определенных полезных штаммов. Понимание того, какие штаммы приживаются, как долго они сохраняются у реципиента и каким генетическим изменениям подвержены, помогает прогнозировать влияние штаммов на клинические исходы и разрабатывать более безопасные и эффективные бактериальные биотерапевтические препараты.

Поскольку стоимость секвенирования длинных прочтений продолжает снижаться, можно предположить, что LongTrack будет применяться для отслеживания передачи штаммов и их изменчивости не только в исследованиях ТФМ, но и в других областях биомедицины.

Каким образом фекальная трансплантация избавляет пациента от клостридиальной инфекции