Конъюгированные с пептидами липидные наночастицы помогут бороться с наследственной слепотой

Наследственная дегенерация сетчатки — сложная группа генетических нарушений, возникающих в результате мутаций в более чем 300 генах. Эти гены важны для работы фоторецепторов (PR) и пигментного эпителия сетчатки (RPE). При нарушении их функции происходит прогрессирующая гибель клеток, что приводит к слепоте. Таким пациентам может помочь генная терапия. Существуют геннотерапевтические средства, такие как Лукстурна, в состав которого входит аденоассоциированный вирус (AAV2) для доставки нормальной копии гена RPE65 в RPE, и EDIT-101, первое лекарство на основе CRISPR. Многие средства генной терапии на основе AAV находятся на стадии доклинических или клинических исследований. Однако AAV имеет недостатки, такие как ограниченная емкость упаковки ДНК (менее 5 т.п.н.), иммуногенность и способность конститутивно экспрессировать нуклеазы Cas9. Есть необходимость в разработке других средств доставки генов для терапии заболеваний сетчатки.

Липидные наночастицы (ЛНЧ) — лучшая невирусная платформа для доставки мРНК. Они имеют хорошо зарекомендовавший себя в клинике профиль безопасности и могут инкапсулировать грузы большого размера. Их синтетические биоразлагаемые компоненты снижают нежелательные иммунные реакции.

Ученые из Университета штата Орегон, а также Орегонского университета науки и здоровья (США) поставили задачу — разработать новую платформу для лечения наследственной слепоты на основе ЛНЧ и мРНК. В своей предыдущей работе они продемонстрировали, что экспрессия белка в сетчатке ограничивается фагоцитирующими клетками RPE и глией Мюллера. При любом методе доставки ЛНЧ так и не смогли проникнуть в PR. В своей новой работе исследователи создали наночастицы, конъюгированные с пептидами, которые могут обеспечить доставку мРНК в PR.

Биологические или синтетические пептиды улучшают доставку лекарств и визуализирующих агентов или нацеливание терапевтических наночастиц. Они могут выполнять как структурную, так и биоактивную роль в зависимости от плотности заряда, гидрофобности, гидрофильности, конформации и химических модификаций. Ученые предположили, что дополнение ЛНЧ короткими олигомерными пептидами будет способствовать их проникновению в PR. Они использовали библиотеку гептамерных пептидов на основе бактериофага M13 для поиска нужных последовательностей. Всего были секвенированы более 150 фаговых бляшек и найдены 30 бактериофагов-кандидатов, нацеленных на PR. Далее с помощью твердофазного ИФА против клеток мышиных колбочек 661w и клеточной линии hARPE19 в качестве контроля авторы выявили наиболее эффективные из них.

По результатам ИФА авторы выбрали три высокосвязывающих пептида (MH50, MH43 и MH42) и один низкосвязывающий (MH3) — для контроля. Чтобы проверить локализацию пептидов в фоторецепторах, ученые синтезировали их и пометили красителем TAMRA. Клетки 661w поглощали в 4,1 и 1,7 раза больше пептидов MH50 и MH42 в сравнении с контролем. Исследователи также проверили проникающие свойства меченых TAMRA пептидов-кандидатов in vivo на мышах линии BALB/c. Краситель был виден в сетчатке через час после интравитреальной инъекции, максимальные уровни наблюдались через шесть часов, а полный клиренс от красителя — через 24 часа. И MH42, и MH50 были локализованы в PR, а также в RPE.

На следующем этапе работы ученые синтезировали наночастицы на основе MH42, содержащие рекомбиназу Cre, и проверили их на мышах линии Ai-9. Эти мыши имеют во всех клетках стоп-кодон выше кассеты tdTomato, которая транслируется только после успешной рекомбинации при доставке Cre. После введения ЛНЧ интравитреально или субретинально трансфекция преимущественно наблюдалась в RPE. При добавлении MH42 экспрессия tdTomato наблюдалась в RPE и PR, а также в клетках Мюллера. Однако те области сетчатки, куда ввели MH42-ЛНЧ, имели нарушенную морфологию, соответствующую потере PR.

Далее способность доставки мРНК с помощью MH42-ЛНЧ была проверена на макаках-резусах. Ученые синтезировали наночастицы, заключающие мРНК зеленого флуоресцентного белка (GFP). Через 48 часов после субретинального введения белок экспрессировался в PR, RPE и клетках Мюллера. Также ученые отметили активацию микроглии и воспаление, опосредованное иммунной системой, что дает дополнительные доказательства успешной доставки мРНК в сетчатку.

Таким образом, исследование показывает, что липидные наночастицы, конъюгированные с пептидами, могут быть мощными инструментами для генной терапии наследственных заболеваний сетчатки. Ученые предполагают, что токсичность и иммуногенность были связаны с дозой ЛНП, и эти эффекты можно смягчить, уменьшив дозу. В своей дальнейшей работе они планируют охарактеризовать иммунный ответ, связанный с доставкой ЛНП-мРНК в сетчатку.

Фоторецепторные клетки человека пересадили собакам