London Calling 2026: от типирования опухоли прямо во время операции до секвенирования черепах

Выступление Роя Уильямса из компании Aspen Neuroscience (США) было посвящено контролю качества терапевтических клеточных продуктов. Один из многообещающих подходов к лечению таких нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Паркинсона, заключается в восстановлении поврежденной нервной ткани с помощью клеточной терапии. Сасинепроцел (sasineprocel), препарат от американской компании Aspen Neuroscience, разработан как раз для такой терапии. Он представляет собой клетки-предшественники дофаминовых нейронов, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток самого пациента. В марте компания объявляла о предварительных результатах фазы I/IIa клинического исследования ASPIRO, которое продолжается до сих пор.

Сасинепроцел разрабатывался как препарат для персонализированного и минимально инвазивного лечения, которое не требует иммуносупрессии благодаря тому, что пациент получает аутологичные терапевтические клетки. Для их получения у пациента берут биопсию кожи, чтобы выделить фибробласты и перепрограммировать их в ИПСК, а затем дифференцировать в клетки-предшественники дофаминовых нейронов. Клиническое применение требует строгого контроля качества на каждом этапе работы с клетками. И остается открытым вопрос — обеспечит ли его секвенирование с помощью технологии Oxford Nanopore, соответствует ли оно требованиям на практике? Ответ на этот вопрос прозвучал в докладе Роя Уильямса на конференции London Calling 2026. 

Контроль качества клеточного препарата включает идентификацию пациента и ее подтверждение, проверку на наличие онкогенных вариантов и вариации числа копий, а также оценку целостности генома. Принятая сейчас практика опирается на несколько платформ — NGS-cеквенирование и анализ на микрочипах. 

Контроль качества начинается с анализа фибробластов, полученных из биоптата кожи пациента. На этом этапе проводят полногеномное секвенирование и определяют, насколько пациент соответствует критериям для включения в исследование. Секвенирование и анализ на микрочипах, в настоящее время применяемые для идентификации пациента и получения его полного генома, обычно занимают 3–4 недели. По словам докладчика, вместо этой комбинации платформ можно применить нанопоровое секвенирование, которое позволяет получить результаты сопоставимой точности за 6 дней.

Следующий шаг — получение ИПСК — требует проверки на наличие онкогенных мутаций и вариаций числа копий (CNV). Такая проверка также занимает 3–4 недели до получения результата; ее также можно проводить методом нанопорового секвенирования и тем самым сократить до 6 дней. 

Наконец, ИПСК пациента подвергают дифференцировке в клетки-предшественники дофаминергических нейронов. На этой стадии требуется аналогичная проверка — подтверждение того, что терапевтический клеточный продукт не содержит патогенных вариантов, которые могли бы представлять опасность для здоровья пациента. 
Воспроизводимость результатов подтвердили на клетках пациентов из собственной выборки. Микрочипы и нанопоровое секвенирование давали сопоставимые результаты при поиске CNV (как делеций, так и дупликаций), результаты секвенирования технологиями Oxford Nanopore и Illumina также хорошо соотносились между собой. Это позволяет сделать вывод, что при сопоставимом качестве можно использовать для контроля качества единственную платформу вместо нескольких, что снизит как сложность, так и затраты времени на анализ. 

Кроме того, нанопоровое секвенирование позволяет проводить функциональную характеризацию клеток по эпигенетическим маркерам — возможность, которой лишен современный стандарт контроля качества. Технология Oxford Nanopore позволяет напрямую измерять метилирование ДНК, не прибегая для этого к бисульфитному секвенированию. В докладе компании говорится, что таким методом удалось подтвердить «обнуление» эпигенетического возраста при дедифференцировке фибробластов в ИПСК. Таким образом, нанопоровое секвенирование — быстрый и в то же время более универсальный метод по сравнению с современным стандартом. Он позволяет экономить время, упрощает сам процесс исследования и вместе с тем предоставляет больше информации. 

Майк Кларк из Мельбурнского университета (Австралия) рассказал об использовании протеогеномики для более полной характеристики транскриптома и протеома. 
Зачем нужна протеогеномика? Ученые далеко не все знают о работе генов. Чтобы узнать больше, нужно изучать РНК, белки, и то, когда и где они экспрессируются. Даже спустя 20 лет после завершения проекта «Геном человека» мы до сих пор не знаем функций многих генов, постоянно открываем новые РНК и белки. 

В первую очередь это связано со сложностью транскриптома и протеома. Один ген может кодировать несколько различных РНК и белков — РНК-изоформ и протеоформ. Есть еще неканоничные (необычные) открытые рамки считывания, которые тоже транслируются, например, uORF (upstream ORF), — они регулируют трансляцию близлежащих каноничных ORF. Также было показано, что многие РНК, которые изначально идентифицировали как длинные некодирующие, тоже кодируют белки.

Еще существуют методологические ограничения. Современные методы упускают многие изоформы и протеоформы. Обычно берут образец с белками, разделяют их на пептиды, прогоняют на масс-спектрометре, получают спектры каждого пептида, которые сравнивают с базой данных известных белков и спектров. То есть белки можно идентифицировать, только если они содержатся в стандартной референсной базе данных. На уровне РНК при использовании коротких прочтений тяжело идентифицировать различные изоформы. 

Протеогеномика позволяет использовать секвенирование РНК, чтобы создать специализированную базу данных всех возможных экспрессируемых белков в образце, идентифицировать и охарактеризовать известные и новые белки.

С помощью протеогеномики можно найти новые неаннотированные неканоничные ORF, увидеть последствия альтернативного сплайсинга для протеома и белки, получившиеся в результате вариантов, мутаций или даже негенетических вариаций (например, редактирования РНК).
Заниматься протеогеномикой не так просто. Нужно хорошо разбираться в секвенировании РНК, протеомике и биоинформатике. 
Группа докладчика разработала программное обеспечение GenomeProt, которое доступно онлайн. Как это работает? Сначала секвенируют РНК с длинными прочтениями, загружают сиквенсы в GenomeProt, выбирают, к какому виду они относятся, и какие ORF хотят найти. Программа вырабатывает базу данных ORF. Затем проводят масс-спектрометрию, но теперь используют полученную базу данных. 

В результате получают информацию, какие гены экспрессируются, какие РНК-изоформы образуются, какие там находятся ORF, транслируются ли они, а также какие пептиды находятся в образце. Еще ученые разработали инструмент для визуализации.

Этот алгоритм уже использовали для анализа остеобластов мышей, клеток меланомы и клеток мозга человека. В последнем случае ученые получили образцы из трех областей мозга человека. Всего детектировали более 90 тысяч РНК-изоформ, из их 2317 новых. Также выявили 224 050 пептидов, 8579 белков и 2020 новых транслируемых ORF. 

Этот подход можно использовать для анализа единичных клеток. Причем только с помощью длинных прочтений можно анализировать изоформы. Подход применили к органоидам коры мозга. Через месяц в образце было много клеток-предшественников, появлялись первые нейроны. Через три месяца было много различных нейронов, через шесть появлялись «поздние» клетки — олигодендроциты и микроглия. 

Бринья Сигурпалсдоттир (Brynja Sigurpálsdóttir) из Amgen deCODE genetics рассказала о проекте, работа над которым еще продолжается, — нанопоровое секвенирование участников UK Biobank. Геномы 50 тысяч участников будут секвенированы с помощью проточных ячеек R10. Они уже были секвенированы с короткими прочтениями.

Этих участников разделят на две группы. Первую — 5000 образцов — прочитают с покрытием около 30x. Сюда войдут семейные пары и трио, а также лонгитьюдные образцы — геномы тысячи человек прочитают дважды (покрытие порядка 60x). Для этой и второй группы доступны данные по протеому и метилому.

Во вторую группу войдут 45 тысяч человек. Их геномы прочитают с покрытием 15x. Они представляют участников проекта в целом.

Проект был запущен в августе 2025 года, когда исследовательская команда получила доступ к первым образцам и приступила к тестированию. Геномы первой группы (с покрытием 30x) уже были прочитаны, сиквенсы выпустят в ноябре 2026 года. К концу 2026 года планируется завершить секвенирование всех 50 тысяч участников. Выпуск всех данных планируется на июнь 2027 года.

Планируется, что благодаря нанопоровому секвенированию исследователи получат больше структурных вариантов, более точно генотипируют длинные повторы, получат больше вариантов в «темных» областях (которые тяжело картрировать). Также будут доступны данные по метилированию — 5mC и 5hmC — и информация по гаплотипам для вариантов и метилирования.

Анализ аллель-специфического метилирования исландских образцов показал, что метилирование коррелирует с уровнем экспрессии гена, но основной драйвер этой корреляции — варианты последовательности ДНК, то есть локусы, контролирующие аллель-специфичное метилирование ДНК. Эти варианты обогащены в 23,3 раза среди вариантов, ассоциированных со всеми чертами, и в 46,4 раза — среди ассоциированных с гематологическими чертами. 

Это важно для понимания роли некодирующих вариантов. Если вариант связан с метилированием, то он может быть более важным.

Исследователи также использовали эпигенетические часы. Их обучали на данных, полученных на бисульфитном секвенировании, так что для перехода на другую платформу их нужно подправить или обучить заново.

Исследователи провели полноэпигеномный поиск ассоциаций (EWAS) на доступных данных и выявили большое число CpG, ассоциированных с чертами, доступными для UK Biobank, особенно гематологическими. Для валидации рассмотрели такую черту, как курение. С помощью бисульфитного секвенирования была показана сильная корреляция курения и CpG в AHRR, ту же связь показали на данных нанопорового секвенирования. Если человек бросает курить, большая часть сигналов нормализуется, но некоторые — нет.

Молекулярный биолог Леннарт Кестер из Центра детской онкологии имени принцессы Максимы (Нидерланды) рассказал о применении нанопорового секвенирования для диагностики рака у детей в режиме реального времени, то есть во время операции. 

Лечение начинается с диагноза, и чем быстрее он будет установлен, тем раньше пациент получит нужную терапию. Особую трудность быстрая постановка диагноза представляет при педиатрических опухолях мозга, поскольку первая линия терапии рака мозга у детей — это, как правило, хирургия. Нейрохирург, оперирующий пациента, не знает в точности, с какой опухолью имеет дело — у него имеется только приблизительная оценка, основанная на данных радиологических исследований. При этом для разных подтипов опухоли требуется различный подход к хирургии, и выбирать стратегию приходится прямо во время операции.

Для решения этой непростой задачи была разработана система Sturgeon, которая позволяет классифицировать опухоли ЦНС по данным нанопорового секвенирования прямо в ходе операции. Классификация основана на профиле метилирования в раковых клетках, причем для нее требуется покрытие не более 0,05х. Определение подтипа опухоли происходит в пределах 90 минут с момента получения образца. Изначально анализ проводили на секвенаторах MinION, затем перешли на PromethION. Сейчас самый долгий этап анализа — это донести образец до непосредственно секвенирования, которое занимает около 10 минут.

Статья, посвященная разработке, была опубликована в 2023 году, однако это была исследовательская часть, которую требовалось внедрить в клиническую практику. «Это может быть самое скучное предложение, которое прозвучит на этой конференции, но в моей презентации оно еще и самое важное», — так прокомментировал Кестер этап получения аккредитации в соответствии со стандартами ЕС. С тех пор система два года применяется в клинике.
Проспективная оценка показала, что интраоперационная молекулярная диагностика действительно изменяла хирургическую стратегию в 14,3% случаев. Число некорректных диагнозов сократилось по сравнению с тем, когда для диагностики использовали только радиологические данные.

Затем применение подхода было расширено — классификатор глубокого обучения Tucan обучили, помимо педиатрических раков ЦНС, на профилях метилирования других солидных опухолей у детей. (Всего в обучающую выборку вошло 3907 профилей метилирования, а валидацию проводили на 514 образцах.) После внедрения в клиническую диагностику проспективная оценка также показала точную классификацию молекулярных подтипов опухолей с помощью Tucan; она занимала не более нескольких часов и порой позволяла получить клинически важные данные. А точный диагноз удавалось установить таким способом в 96,6% случаев.

Параллельно с этим был создан еще один классификатор, уже для детских онкогематологических заболеваний. Он получил название Lamprey, его обучили на более чем 5400 профилях метилирования, охватывающих более 40 подтипов лимфоидного и миелоидного лейкоза. В сочетании с секвенированием система позволяет получить подробную молекулярную характеристику опухоли, включая не только метилом, но и геномные перестройки и точечные мутации. Результаты можно получить за 24 часа с момента сбора образца. И, в отличие от диагностики опухолей ЦНС, классификация с помощью Lamprey не завязана на оперативное вмешательство. 
Совокупность этих подходов — к диагностике опухолей ЦНС, других солидных опухолей и лейкемий, — наглядно демонстрирует, как нанопоровое секвенирование может ускорить получение клинически значимых результатов. 

В клинике чаще всего используется полногеномное секвенирование с короткими прочтениями (srWGS). При этом считается, что полногеномное секвенирование с длинными прочтениями (lrWGS) может решить задачи диагностики, которые не удается решить стандартными методами. Но для этого lrWGS необходимо клинически валидировать. Также остаются открытыми вопросы о точности метода. Себастьян Лунк из Службы клинической генетики штата Виктория (Австралия) показал, что lrWGS от Oxford Nanopore Technologies обладает достаточной точностью для клинического применения и даже имеет ряд преимуществ перед короткими прочтениями.
Исследователи провели валидацию эквивалентности клинически аккредитованному методу srWGS, используя как эталонные контрольные образцы, так и ранее проанализированные клинические образцы. 

lrWGS показало эквивалентные или лучшие результаты, чем srWGS, практически во всех анализируемых категориях, за исключением небольших индел-вариантов в регионах с низкой сложностью. Метод позволяет тестировать области генома, недоступные для srWGS. lrWGS демонстрировало ясную картину сложных генетических событий, его можно интегрировать с рутинные диагностические процессы. 

При этом нужно привыкнуть к новым алгоритмам, в том числе биоинформатическим, и знать ограничения метода. По словам докладчика, метод не совершенный, но имеет преимущества и предоставит много дополнительной релевантной информации. 

lrWGS позволяет детектировать SNV, вариации числа копий, структурные варианты, экспансии повторов и эпигенетические модификации. Хагар Мор-Шакед из Медицинского центра Хадасса (Израиль) рассказала об опыте использования lrWGS.

В период с 2023 по 2026 год было проанализировано в общей сложности 126 геномов. Библиотеки были подготовлены с использованием стандартного протокола лигирования Oxford Nanopore Technologies и секвенированы на платформе PromethION 24, что позволило получить 90–100 Гб данных на образец (~30-кратное покрытие). Файлы POD5 были определены с помощью Guppy в режиме высокой точности (HAC, 400 bps), а риды были выровнены по референсному геному hg38 с использованием minimap2 в рамках Sentieon. Анализ коротких тандемных повторов (STR) был выполнен с помощью Straglr, а файлы формата VCF были аннотированы с помощью Geneyx Analysis.

Клинические применения включали анализ гаплотипов (n=20), гаплотипирование, связанное с преимплантационной генетической диагностикой (n=13), валидацию нарушений импринтинга (n=4), анализ вариантов-модификаторов (n=15), фазирование de novo (n=2), недиагностированные случаи (38 одиночных случаев и 2 трио), валидацию вариантов псевдогенных регионов (n=4) и валидацию экспансии повторов (n=24). Выявление экспансии повторов продемонстрировало чувствительность 94% с точным определением размера аллелей, в то время как все случаи нарушений импринтинга показали отчетливые сигнатуры метилирования. 

Алессандра Рениери из Университета Сиены (Италия) совместно с группой исследователей из Павии сравнила эффективность нанопорового секвенирования от Oxford Nanopore и секвенирования с короткими прочтениями. Всего было проанализировано более 200 образцов. Оказалось, что данные Oxford Nanopore соответствуют данным секвенирования с коротким прочтением при обнаружении патогенных вариантов (таких как SNV) и позволяют выявлять ранее не обнаруженные сложные варианты (такие как SV и короткие тандемные повторы).

Группа докладчицы проанализировала еще 200 образцов на PromethION 24. 

В результате нанопоровое секвенирование увеличило выход результатов в недиагностированных случаях примерно на 40%. Даже в уже диагностированных случаях (с SNV) второй патогенный вариант (SV или STR) был обнаружен примерно в 30% случаев, что завершило диагностику. Аналогично, в случаях, диагностированных с помощью aCGH (геномная гибридизация на микрочипах), второй диагноз был обнаружен примерно в 30% случаев, иногда более важный для ведения пациента, чем первый.

По мнению докладчицы, постановка пренатального, досимптоматического или прогностического диагноза с применением персонализированных профилактических мер, основанных исключительно на однонуклеотидных вариантах (NGS) или исключительно на вариациях числа копий (aCGH), или на обоих методах (при удвоении затрат), делает генетическую диагностику неполной, приводя к неточным выводам клинического генетика и даже к прогностическим и терапевтическим диагностическим ошибкам.

Глобальное изменение климата угрожает существованию более 400 видов с температурозависимым определением пола, в том числе всем видам морских черепах. В ходе эмбрионального развития рост температуры может повысить число организмов одного пола, снизить жизнеспособность вида и привести к вымиранию, если только не существует адаптивных механизмов (поведенческих, физиологических или молекулярных), снижающих влияние температуры. 

Точность прогнозов изменения количества морских черепах при глобальном потеплении тяжело оценить, так как существует мало информации об их геномах и эпигеномах. Более того, нет метода, позволяющего быстро и надежно определить пол особи без вреда для нее.

Эжени ‘Чарли’ Йен из Лондонского университета королевы Марии рассказала, как ее группа использовала нанопоровое секвенирование от Oxford Nanopore Technologies для того, чтобы выявить дифференциально метилированные сайты у самок и самцов морских черепах.

ДНК выделяли из образца кожи, полученного с помощью биопсии. Анализировали черепах Chelonia mydas из двух популяций — Гавайи и Западная Австралия. Черепахи из гавайской популяции погибли от естественных причин, а из австралийской — были убиты в ходе эксперимента более 10 лет назад и сохранены.

Для подготовки библиотеки использовали SQK-LSK114 Ligation Sequencing Kit, секвенировали на PromethION P2 Solo (химия R10.4.1), применяли Dorado v1.1.1 и Modkit v.0.5.0.

Исследователи идентифицировали дифференциально метилированные области (DMS) между самками и самцами в двух популяциях и выделили общие. В конце-концов они идентифицировали 24 DMS, которые подходят для определения пола у черепах.

Нанопоровое секвенирование также использовали в нескольких работах, изучающих птиц Галапагосских островов, о которых рассказал Хайме Чавес из Университета штата Калифорния в Сан-Франциско. Эти острова — «живая лаборатория», в которой живут разнообразные виды с уникальной эволюцией, в том число большое количество эндемичных видов. Есть и инвазивные виды, угрожающие видам местным. Человеческая деятельность также способствует деградации мест обитания.

В то же время для большинства видов нет информации об их популяции, генетическом разнообразии (инбридингу и эволюционному потенциалу), географическом распределении генетических вариантов (линий, подвидов). Также нет общего контроля за усилиями по сохранению видов. Это связано в том числе с географической удаленностью островов. Вывоз образцов находящихся под угрозой вымирания видов затруднен, а на островах нет инфраструктуры для секвенирования.

Получение референсных геномов может помочь в сохранении видов, дав более точную информацию о генетическом разнообразии (участках гомозиготности и инбридингу) и архитектуре пангенома, позволив различить адаптивные и нейтральные эволюционные процессы, идентифицировать функциональные генетические варианты, связанные с фенотипом, приспособленностью и адаптивным потенциалом, определить популяции, экотипы и виды.  

Популяция темной чайки (Leucophaeus fuliginosus) крайне мала — 300–600 особей. Более того, эта популяция фрагментирована, что повышает риск вымирания. Инвазивные виды — кошки, крысы и собаки — поедают яйца и птенцов. Чайки несут яйца вблизи человеческих поселений, так что нарушение и загрязнение их среды обитания представляет проблему. Более того, темные чайки часто попадаются на рыболовные крючки или испытывают недостатки в ресурсах из-за избыточного вылова рыбы. Ученые использовали Oxford Nanopore Ultra-Long DNA Sequencing Kit и PromethION 2 Solo для того, чтобы получить референсный геном темной чайки.

Галапагосский тайфунник (Pterodroma phaeopygia) — вид, находящийся на грани полного исчезновения. Его численность снизилась примерно на 80% за последние 60 лет. Кошки, крысы, собаки и свиньи поедаю яйца и новорожденных птенцов, кусты малины перекрывают входы в гнезда, в них также запутываются взрослые птицы. 

Использование земли человеком, в том числе для сельского хозяйства, приводит к фрагментации популяции тайфунника. Нанопоровое секвенирование использовали для получения первого высококачественного референсного генома галапагосского тайфунника.

Максимальная длина скаффолдов у этих двух референсных геномов составила 218 т.п.н. И 221 т.п.н., покрытие 22,5x и 36,08x, однако полнота сборки по BUSCO составила 99,95% и 99,94%. Референсные геномы по качеству сравнимы и иногда превосходят референсные геномы родственных видов.