Макрофаги утилизируют митохондрии с помощью микроаутофагии

Клетки обладают различными механизмами поддержания гомеостаза, одним из которых является аутофагия. Данный механизм (в частности, аутофагия митохондрий) задействован в том числе в активации и поляризации макрофагов. Помимо «классической» макроаутофагии — она подразумевает формирование двумембранных аутофагосом, которые доставляют подлежащие разрушению компоненты к лизосомам, —внимание ученых в последнее время привлекает микроаутофагия. При ней приспособленные для деградации одномембранные органеллы «всасывают» субстраты внутрь через инвагинации мембраны. При этом долгое время оставалось неясным, как подобный механизм может быть реализован в клетках млекопитающих, поскольку их лизосомы (основные кандидаты на роль везикул для микроаутофагии) меньше большинства органелл.   

 Credit:  Пресс-релиз

Ученые из Японии описали в мышиных макрофагах костномозгового происхождения и остеокластах специализированные лизосомоподобные органеллы (lysosome-related organelles, LRO), характеризующиеся наличием малых ГТФаз Rab32 и Rab38. Эти одномембранные органеллы имеют общие черты с лизосомами — наличие мембранного белка Lamp1 и закисление внутренней среды с помощью V-АТФазы, — однако они значительно крупнее (около 2000 нм против 100 нм у обычных лизосом). Эти характеристики позволяют рассматривать LRO в качестве органелл, участвующих в микроаутофагии.

Сначала исследователи с помощью световой и электронной микроскопии показали, что Rab32⁺-LRO способны захватывать внутриклеточные мембранные структуры, включая эндосомы. Характерные для эндосом белки Rab5A и Rab7 обнаруживались внутри Rab32⁺-LRO, а ингибирование протонной помпы бафиломицином A1 подавляло деструкцию захваченных структур и способствовало накоплению внутри LRO различных мембранных органелл, в том числе эндосом.

Помимо маркеров эндосом в Rab32⁺-LRO также обнаруживался митохондриальный маркер Tomm20, — это указывает на способность Rab32⁺-LRO захватывать митохондрии. Их поглощение усиливалось при обработке клеток токсичными для митохондрий препаратами олигомицином A и антимицином A (OA). С помощью флуоресцентного реагента Mtphagy Dye, разработанного специально для визуализации митофагии, исследователи показали, что транспорт митохондрий в Rab32⁺-LRO связан именно с их селективной аутофагией. В макрофагах костномозгового происхождения двойной нокаут Rab32/38 ослаблял этот сигнал как при действии OA, так и при обработке другим повреждающим митохондрии веществом — карбонилцианид м-хлорфенилгидразоном (CCCP). С помощью световой и электронной микроскопии и трехмерных реконструкций ученые визуализировали процесс поглощения митохондрий Rab32⁺-LRO.

Ученые также продемонстрировали, что для макрофагов микроаутофагия является преобладающим путем деструкции митохондрий. В отличие от клеток HeLa, где при повреждении митохондрий проявлялась макроаутофагия, в макрофагах преобладали структуры Lamp1⁺-митохондрий, но не ассоциированных с аутофагосомами LC3⁺ — это признаки микроаутофагии. Кроме того, нокаут генов, кодирующих ключевые для макроаутофагии белки Atg7 и Rb1cc1, не приводил к ослаблению сигнала Mtphagy Dye в макрофагах.

Ключевым компонентом Rab32-зависимой микроаутофагии является фосфатидилинозитол (3,5)-бифосфонат (PtdIns(3,5)P₂). При обработке клеток апилимодом, ингибитором фосфатидилинозитол фосфат киназы PIKfyve, в мембране Rab32⁺-LRO переставали формироваться характерные для микроаутофагии инвагинации. Эффект сохранялся даже при конститутивной активации Rab32. При этом ученые не выявили ассоциации между Rab32⁺-LRO и белками комплекса ESCRT, задействованного в микроаутофагии в других клетках.

Решающим сигналом для отправки поврежденных митохондрий на деградацию выступает убиквитинирование. Подавление этого процесса при помощи TAK243 — ингибитора E1-лигазы (она участвует в присоединении убиквитиновой метки) — приводило к нарушению импорта митохондрий в Rab32⁺-LRO несмотря на продолжающееся формирование инвагинаций в мембранах. Также для процесса оказался важен адаптер убиквитина p62/SQSTM127, который рекрутировался к поврежденным митохондриям и «сопровождал» их в LRO. Его нокдаун снижал интенсивность митофагии. При этом не было показано влияния на митофагию в макрофагах ранее описанных для нейронов и клеток HeLa молекулярных сигналов «съешь меня» — кардиолипина и гетеродимера NIPSNAP1/2. Это свидетельствует о наличии в макрофагах особого пути инициации микроаутофагии поврежденных митохондрий.

Известно, что под действием липополисахарида (LPS) и сигналов от T-хелперов 1 типа (в частности, IFN-γ) происходит активация макрофагов по «классическому» пути и приобретение ими провоспалительного M1-фенотипа. Это сопровождается переходом от окислительного фосфорилирования к гликолизу, что требует утилизации «лишних» митохондрий с помощью митофагии. Исследователи показали, что воздействие LPS и IFN-γ приводит к убиквитинированию и фрагментации митохондрий, а затем их перемещению в LRO, причем полный процесс разрушения занимает около 24 часов. Кроме того, под действием LPS и IFN-γ отмечалось усиление выработки маркеров M1-фенотипа IL-6, IL-1β и TNF-α. В клетках с двойным нокаутом Rab32/38 выработка этих цитокинов была нарушена, а уровень митохондриального дыхания оставался неизменным, что свидетельствует о нарушении перехода к гликолизу.

Авторы исследования подчеркивают, что микроаутофагия и, в частности, микромитофагия имеет большое значение в поддержании гомеостаза в макрофагах и представляет собой энергоэкономичный путь утилизации органелл, что важно для этих клеток, подверженных динамическим изменениям. Полученные данные расширяют представления о механизмах деградации органелл и их роли в иммунном ответе.