Метилированный аденозин влияет на экспрессию генов в ходе гемопоэза

Регуляция экспрессии гена происходит в том числе с помощью различных модификаций РНК. У млекопитающих самая распространенная модификация — это метилирование аденозина по шестому положению (m6A). Однако методы секвенирования для ее обнаружения до сих пор остаются несовершенными. Одни протоколы не позволяют определить метилированный аденозин с разрешением в один нуклеотид, а другие — оценить информацию о стехиометрии модификации (то есть о том, как много молекул содержит метилированный аденозин в этой позиции). Ученые из США разработали новый способ секвенирования, который учитывает все перечисленные недостатки прошлых протоколов — m6A-SAC-seq.

Детекция метилированного аденозина в m6A-SAC-seq основана на мутагенезе. К исследуемому образцу добавляют S-аденозил-L-метионин с аллильной группой (аллил-SAM) и метилтрансферазу MjDim1. Фермент переносит аллильную группу с аллил-SAM на шестой атом азота аденозина. Интересно, что наиболее чаще в реакции участвует уже метилированный аденозин. Последующая обработка йодом приводит к образованию цикла.

Для обнаружения метилированного аденина ученые использовали обратную транскриптазу ВИЧ. Она способна синтезировать РНК через подобные циклические структуры, но при этом образуются мутации. Таким образом, после выравнивания прочтений на референсный траскриптом метилированные аденозины будут иметь очень высокую изменчивость.

Благодаря новой технологии ученые показали, что наличие и положение метильной метки влияет на метаболизм РНК. Метилирование аденозина приводило к ускорению деградации молекулы, кроме транскриптов с m6A в 5’-нетранслируемой области.

Ученые выяснили, что в регуляции метаболизма участвуют специальные белки. Так, например, отсутствие m6A-связывающего белка YTHDF2 приводило к снижению стабильности транскриптов с m6A в 5’-нетранслируемой области.

Также исследователи обнаружили связь между m6A и сплайсингом РНК. Оказалось, что вблизи сайта сплайсинга очень мало метилированных аденозинов. Тем не менее, 5’-конец интронов обогащен этой модификацией относительно других областей. Оказалось, что m6A влияет на альтернативный сплайсинг.

Исследователи заметили, что области с метилированным аденином образуют более стабильные вторичные структуры. Известно, что это повышает эффективность трансляции.

Благодаря новому методу исследователи проследили динамику метилирования аденозина во время клеточной дифференцировки. Они обратили внимание на моноцитопоэз, во время которого эпигенетические события и экспрессия генов строго контролируются. Для анализа они собрали образцы на день 0, 3, 6 и 9 (последний) дифференцировки и секвенировали их. Всего они нашли от 20 до 32 тысячи сайтов m6A в более чем 9 тысячах транскриптов.

Наиболе часто метилированный аденозин встречался в кодирующей и 3’-нетранслируемой областях. В интронах стехиометрия метилированных сайтов колебалась от 25 до 75%. Многие из модифицированных транскриптов регулируют гемопоэз, например, RUNX1, FOS, ZEB2 и ETV6. Более того, метилированный аденозин был найден в генах, участвующих в создании и удалении этой модификации. Это указывает на механизмы саморегуляции.

Исследователи обнаружили, что количество m6A играет значительную роль в регуляции дифференцировки клеток. Так, уровень метилирования вблизи стоп-кодонов уменьшался во время дифференцировки гемопоэтических клеток, но восстанавливалась после нее. Функциональный анализ генов с помощью GeneOnthology показал, что чаще всего изменение в метилировании аденина наблюдается в генах, ответственных за репарацию и клеточный цикл. В то же время гены, связанные с активацией миелоидных клеток, иммунным ответом и сплайсингом РНК почти не меняли уровень своей модификации.

Ученые нашли гены, экспрессия которых регулируется с помощью m6A. Среди них —транскрипционные факторы, важные для регуляции развития моноцитов. Например, доля m6A в гене KLF4 увеличивалась вместе с повышением уровня транскрипта между днем 6 и 9; схожее наблюдение было сделано для гена EGR1 между днем 0 и 3. В то же время уровни модификации транскриптов генов SPI1 и CEBPA снижались, а экспрессия возрастала между днем 0 и 3.

Ученые считают, m6A-SAC-seq послужит золотым стандартом и позволит сделать новые биологические открытия.