Мутагенез генома бактерии повысил выработку необходимых для генной терапии плазмид

Плазмидная ДНК — необходимый компонент генной терапии. По мере внедрения терапии в клиническую практику растет и нужда в такой ДНК. Но в E. coli плазмид не так уж и много, а изолировать их дорого, так что стоимость грамма изолированной плазмидной ДНК может достигать 100 000 долларов. Снизить цену можно, увеличив число плазмид в бактериальной клетке, желательно, не изменяя последовательность самой плазмиды.

Репликация плазмиды — сложный процесс, в котором участвуют многие белки клетки-хозяина. Нокаут recA и endA подавляет деградацию плазмиды и нежелательную рекомбинацию, в то время как оверэкспрессия ligA способствует более эффективному восстановлению разрывов во время репликации плазмиды. Кроме того, генная инженерия центральных генов метаболизма углерода, таких как pykA и pykF, стимулирует биосинтез нуклеотидов и уменьшает накопление побочных продуктов, таких как ацетат. В новой работе исследователи из США использовали мутагенез, чтобы воздействовать одновременно на несколько генов и повысить выход плазмид. Чтобы внести мутации, использовали недавно описанную плазмиду для мутагенеза, индуцируемого ангидротетрациклином (aTc-MP6), с последующим скринингом с помощью репортерной плазмиды, которую помещали в мутированную библиотеку. Клетки с высоким показателем флуоресценции, соответствующие большому количеству плазмид, были выделены и проанализированы.

В норме в ходе репликации ДНК E. coli возникает 10^-9–10^-11 ошибок на пару оснований. Методы мутагенеза in vivo увеличивают частоту мутаций и ускоряют эволюцию бактериальных клеток. Плазмида aTc-MP6 способна индуцировать все 12 замен оснований, чаще всего — переход T:A↔C:G. Этот паттерн мутаций, вероятно, обусловлен нарушением механизмов репарации ошибочно спаренных оснований из-за оверэкспрессии генов, кодируемых на MP6: dam и seqA. aTc-MP6 вызывает мутации по всей бактериальной хромосоме.

В качестве репортера авторы использовали плазмиду pUC, экспрессирующую GFP под действием слабых промоторов (J23106, J23107 и J23116), чтобы изначальный уровень флуоресценции был низким, и слабых сайтов связывания рибосом (B0032m, B0033m и BCD8). Комбинация J23116 и B0032 показала самые низкие уровни экспрессии и использовалась в дальнейшем.

После мутагенеза штамма NEB 5α и внесения репортерных плазмид авторы оценили состояние последних. NEB 5α в основном производили сверхспирализованые мономеры, вариант М1 — димеры и тетрамеры, М2 — тримеры, пентамеры и гексамеры. Вероятно, мультимеризация происходила из-за изменений в гене recA1 и стимулирования рекомбинации.

Ген recA1 удалили из генома бактерии с помощью системы CRISPR-Cas9 и провели еще раунд мутагенеза. Полученный вариант M3 производил мономерные плазмиды в большом количестве. Авторы опробовали еще две плазмиды — gWiz, разработанную для экспрессии в клетках млекопитающих, и pAAV-CAGG-eGFP, аденоассоциированный вирусный вектор для применения в генной терапии. Количество всех плазмид выросло в M3. Мутагенез не затронул плазмиды.

Авторы наблюдали увеличение числа репортерной плазмиды с GFP в 5,93 раза, увеличение числа плазмиды gWiz в 1,93 раза и увеличение числа pAAV-CAGG-eGFP в 8,7 раза (все с ориджином pUC). Кроме того, плазмиды с ориджинами p15A и pSC101 показали 1,44-кратное и 1,68-кратное увеличение числа плазмид соответственно.

Выработку плазмид штаммами NEB 5α и M3 оценили в литровом биореакторе. Через 8 часов культивирования бактерии M3 росли чуть медленнее, но давали больше плазмид (в 2,3 раза).

Полногеномное секвенирование M3 выявило 85 мутаций в геноме бактерии. Дополнительный анализ позволил предположить, что причина роста числа плазмид — в том числе в мутации recG R584H. Так, если ее убрать из генома M3, то число плазмид снизится на 63%. Но, походе, что другие мутации тоже влияют на фенотип — одной только мутации recG недостаточно для увеличения числа плазмид в штамме дикого типа. recG кодирует хеликазу, участвующую в репарации ДНК и регрессии репликативной вилки. Замена R584H может изменить функцию RecG таким образом, что в контексте дополнительных мутаций этот белок способствует созданию клеточной среды, благоприятной для репликации плазмиды, — потенциально за счет изменения динамики репликативной вилки, снижения стрессовых реакций или косвенного усиления специфичных для плазмиды механизмов репликации.

В бактерии Vibrio natriegens удобнее наращивать плазмиды, чем в кишечной палочке