В бактерии Vibrio natriegens удобнее наращивать плазмиды, чем в кишечной палочке

Получение компетентных клеток Escherichia coli и их последующая трансформация — один из важнейших методов в молекулярной биологии. Выделение плазмид из бактериальной культуры с помощью коммерческих наборов не представляет больших сложностей, однако получение компетентных клеток кишечной палочки и их трансформация путем электропорации или теплового шока весьма трудозатратны. Ученые из Корнелльского университета (США) предложили наращивать плазмиды в быстрорастущей бактерии Vibrio natriegens. Они показали, что получение компетентных клеток и трансформация V. natriegens — значительно менее сложный процесс, чем использование E. coli.

В течение последних десяти лет V. natriegens все чаще заменяет кишечную палочку в синтетической биологии и других сферах. Эта бактерия очень быстро растет (в богатой питательными веществами среде время удвоения составляет 10 минут), эффективно поглощает субстрат, в том числе в анаэробных условиях, и может расти даже на самых бедных субстратах, таких как формиат и ацетат. Кроме того, в анаэробных условиях она способна фиксировать азот. Для молекулярной биологии V. natriegens также представляет большой интерес, поскольку обладает большим потенциалом для естественной компетентности. Представители семейства Vibrionaceae, включая V. natriegens, становятся компетентными при голодании в присутствии хитина. Искусственная активация экспрессии главного регулятора компетентности tfoX позволяет добиться состояния компетентности клеток в отсутствие хитина, но тоже при голодании. Авторы разработали протокол для трансформации V. natriegens плазмидами в биотехнологических целях.

Сначала из клеток V. natriegens с помощью CRISPR-системы удалили ген dns, кодирующий внеклеточную нуклеазу, которая может повлиять на эффективность трансформации. Далее гетерологичный ген tfoX от V. cholerae внедрили в бактерии. Получение штамма V. natriegens с tfoX оказалось очень низкоэффективным и трудозатратным процессом, и в итоге ученые остановились на одном штамме, обозначенном как Vn NC1. У этого штамма не работает ген lacI, так что нельзя индуцировать экспрессию tfoX с помощью вещества IPTG.

На следующем этапе авторы разработали среду, в которой можно было бы как наращивать бактериальную культуру штамма Vn NC1, так и проводить трансформацию. В известном ранее протоколе рост клеток происходил в богатой среде, а далее клетки инкубировали в бедной среде, полученной за счет разбавления искусственной морской водой. Ученые показали, что минимальная среда, в которой клетки V. natriegens сохраняют компетентность, состоит из искусственной морской воды и ацетата. Предыдущие исследования продемонстрировали, что V. natriegens может расти на ацетате как единственном источнике углерода.

Наконец, авторы разработали две версии протокола трансформации V. natriegens: высокоэффективный, который включает этап заморозки и хранения при -80 °C (HE), и протокол, при котором все манипуляции проводятся при комнатной температуре и не требуют дополнительного оборудования (zero capital). В обоих случаях отдельные колонии Vn NC1 скалывают с чашек, помещают в 20 мл минимальной среды и выращивают без перемешивания в течение ночи при температуре 30°C для протокола HE или 20°C для zero capital. В протоколе HE из каждой культуры отбирают аликвоты по 350 мкл, смешивают с глицерином и замораживают для последующих трансформаций. По протоколу HE после разморозки клетки инкубируют с плазмидной ДНК при 30°C без перемешивания и высаживают на чашки без смены среды. Протокол zero capital отличается температурой инкубации (20 °C) и отсутствием этапа заморозки.

В отличие от стандартных протоколов трансформации E. coli, требующих использования особого оборудования и проведения манипуляций на льду, новый протокол трансформации V. natriegens может найти широкое применение, например, «в школьных и домашних лабораториях и для биологических стартапов», по словам Дэвида Шпехта, первого автора исследования.

Биопечать опухолевых органоидов поможет быстро выявить чувствительность к лекарствам