Бактерии используют одноцепочечные ДНК как ловушки для фаговых SSB белков

У бактерий есть множество систем защиты от вирусов. Одна из наиболее известных — система CRISPR-Cas — вырезает кусочки генома вирусов и встраивает в бактериальный геном, чтобы использовать эти участки для распознавания генетического материала вирусов при повторной инфекции. В случае заражения клетки РНК-вирусами фрагменты РНК сначала переводятся в ДНК при помощи РНК-зависимых ДНК-полимераз (обратных транскриптаз, или ревертаз). Известен целый ряд бактериальных противовирусных механизмов, включающих в себя эти ферменты, например, группа обратных транскриптаз DRT (defense-associated reverse transcriptase), локализованных в защитных островках бактериального генома. Ранее механизм действия был описан только для одной из девяти известных DRT – DRT2. Ученые из Китая исследовали механизм действия DRT9. В бактериальном геноме этой ревертазе предшествует последовательность некодирующей РНК (нкРНК), играющая ключевую роль в противовирусном ответе.

Эксперименты с DRT9-положительным штаммом Escherichia coli подтвердили антифаговую активность фермента, особенно против фагов подсемейства Tevenvirinae. При этом бактериальные клетки переставали расти, что свидетельствует об абортивном механизме защиты (гибель или подавление роста инфицированных клеток, останавливающие распространение фага). Хроматография и РНК-секвенирование показали, что DRT9 формирует устойчивый комплекс с предшествующей ему нкРНК. Удаление как нкРНК, так и гена DRT9 приводило к потере защитной функции.

При помощи криоэлектронной микроскопии ученые установили пространственную структуру комплекса DRT9-нкРНК. Шесть протомеров фермента собираются в «тример из димеров» треугольной формы. Ревертаза включает в себя консервативные домены — «пальцы», «ладонь» и «большой палец», а также дополнительный C-концевой сайт связывания нкРНК. Некодирующая РНК в составе комплекса имеет древоподобную вторичную структуру. Нарушение четвертичной структуры комплекса приводило к утрате противовирусной активности.

Ученые показали, что синтез длинных комплементарных ДНК (кДНК) на матрице нкРНК идет при избытке дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ). Инициация транскрипции происходит на позиции U124 (урацил). Исследователи предположили, что в таком случае для начала транскрипции будет достаточно избытка дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), а не всех четырех дНТФ. Серия экспериментов подтвердила это предположение: избыток дАТФ был достаточен для синтеза кДНК, а недостаток дАТФ ингибировал этот процесс. Продуктом обратной транскрипции оказалась одноцепочечная поли(А)-богатая последовательность, что согласуется с необходимостью избытка дАТФ при синтезе.

Чтобы изучить, как комплекс DRT9-нкРНК взаимодействует с вирусами, исследователи выделили и проанализировали генетический материал фагов T4 и T5, переживших иммунный ответ E. coli. Оказалось, что эти вирусы несут мутации в генах nrdA и nrdB, кодирующих рибонуклеотидредуктазы — ферменты, превращающие рибонуклеотиды в дезоксирибонуклеотиды. В зараженных клетках наблюдалась сниженная концентрация дНТФ. Это значит, что система DRT9-нкРНК активируется повышением дАТФ при фаговом заражении, а мутации в ферментах NrdAB снижают концентрацию дНТФ (в том числе дАТФ), позволяя вирусам избегать иммунного ответа бактерий.

Исследователи показали, что кДНК, обогащенные поли(А)-последовательностями напрямую связываются с фаговым белком SSB (single-stranded DNA binding), необходимым для репликации ДНК вируса, и тем самым препятствуют его нормальному функционированию. Такой механизм был подтвержден как in vitro, так и in vivo с помощью коиммунопреципитации и pull-down анализа. Эти данные указывают на то, что защита, реализуемая DRT9, основана на «отвлечении» ключевого фагового белка поли(А)-кДНК и тем самым нарушении репликации вируса.

Таким образом, система DRT9 реализует необычную стратегию защиты от фагов: в ответ на инфекцию она синтезирует длинные поли(А)-обогащенные одноцепочечные кДНК, которые связывают жизненно важный для репликации фага белок SSB и блокируют распространение вируса. Это открытие не только еще раз демонстрирует многообразие защитных механизмов прокариот, основанных на обратной транскрипции, но и открывает перспективы разработки новых биотехнологических инструментов.

Холерный вибрион против бактериофага: битва малых РНК