Новый инструмент для редактирования ДНК с высокой точностью вставляет в геном целые гены

Методы редактирования генома, в том числе встраивания протяженных участков, постоянно совершенствуются. Статья, опубликованная в Nature в конце апреля, отмечает очередную веху: в геном клеток в культуре успешно встроены фрагменты, по размеру сопоставимые с генами.

Изначально для редактирования больших фрагментов генома методом CRISPR-Cas использовали репарацию двухцепочечных разрывов. Участок мишень повреждали CRISPR-Cas, а клетка самостоятельно залечивала повреждения с помощью собственных механизмов — негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологично-направленной репарации (HDR), причем роль матрицы выполняла донорная ДНК, доставляемая в клетку одновременно с редактирующей конструкцией. Но при этом возникало большое количество инделов, а двухцепочечные разрывы снижали жизнеспособность клеток.

Прайм-редактирование (prime editing, PE) было разработано в лаборатории Дэвида Лю (Институт Бродов) в 2019 году. CRISPR-редактирование в нем дополнено использованием фермента обратной транскриптазы и особой РНК (pegRNA — prime editing guide RNA, направляющая РНК для прайм-эдитинга), которая и нацеливает Cas9 на мишень, и служит матрицей для редактирования. Никаза Cas9 с пришитой к ней транскриптазой разрезает одну из нитей ДНК, затем обратная транскриптаза достраивает нить в месте разреза, используя pegRNA в качестве матрицы. После этого вторую нить восстанавливают клеточные системы репарации. В отличие от других вариантов CRISPR-редактирования, прайм-редактирование не задействует гомологично-направленную рекомбинацию, что повышает эффективность и снижает число ошибок.

В 2021 году группа Дэвида Лю предложила модификацию прайм-редактирования — двойное прайм-редактирование (twinPE). В этом случае две направляющие РНК для прайм-эдитинга отжигаются на две комплементарные нити, что приводит к замене протяженного фрагмента (десятки и даже сотни пар нуклеотидов).

Эти методы эволюционировали и далее, например, вместо обратной транскриптазы использовались сериновыеинтегразы. Однако безопасность интеграз недостаточно изучена, а значительная сложность редактирующей системы создает проблемы с доставкой. В качестве донорных матриц обычно используются плазмиды, которые плохо проникают в клетки и могут вызывать врожденного иммунного ответа in vivo. Остается также проблема «рубцов» (инделов и нуклеотидных замен) на границе вставки. В итоге подходы, основанные на twinPE, все же были недостаточно эффективны для вставок фрагментов, по размеру сопоставимых с генами (800 п.н. и более), вероятно, из-за нестабильности направляющей РНК, недостаточной эффективности синтеза ДНК обратной транскриптазой и других факторов. Существует потребность в системе редактирования, способной обойти все эти проблемы.

Группа исследователей из Медицинского колледжа Университета штата Огайо и Медицинской школы Чан Университета Массачусетса разработала метод «бесшовной» интеграции протяженных фрагментов донорской ДНК в геном. Метод назвали prime assembly — «прайм-сборка», в честь простой технологии молекулярного клонирования, то есть сборки крупных фрагментов ДНК для последующей репликации, который предложил Дэниэл Гибсон из Института Крейга Вентера. (Кстати, недавно ушедший от нас Крейг Вентер и другие сотрудники JCVI были соавторами его статьи о сборке ДНК; именно с помощью этого метода был получен полный синтетический геном Mycoplasma genitalium.)

Авторы новой статьи использовали вместо плазмид линейную донорную ДНК с концевыми участками, гомологичными двум участкам, созданным с помощью twinPE. В культивируемые человеческие клетки HEK293T ввели плазмиды, кодирующие оптимизированный прайм-редактор PE6c и направляющие РНК, а также линейную донорскую ДНК. В локус-мишень клеточного генома успешно встроился фрагмент длиной 8000 п.н. Эффективность редактирования зависела от длины так называемого «лоскута» (flap) — последовательности, замененной редактором twinPE; она была низкой при длине флапов 13 нуклеотидов и высокой — при 30–50 нуклеотидов. Также на надежность редактирования влияло содержание GC в последовательностях флапов. Доля локусов-мишеней, содержащих встройку, приближалась к 40%, точность редактирования превышала 90%.

Чтобы проверить, не участвуют ли клеточные механизмы репарации в прайм-сборке, авторы обрабатывали редактируемые клетки их ингибиторами. Результаты показали, что прайм-сборка не зависит от прогрессии клеточного цикла или гомологично-направленной репарации. Ингибитор негомологичного соединения концов (NHEJ) увеличил долю инсерций. Авторы также проверили, как изменятся показатели прайм-сборки, если использовать донорскую ДНК с выступающими 3’-концами, которые могут лучше взаимодействовать с PE-фрагментами, и этот подход повысил точность встраивания.

Прайм-сборка позволяет вставлять в геном последовательности двух или трех донорских ДНК с перекрывающимися концевыми участками (авторы назвали данный подход «имитацией сборки Гибсона»). Это дополнительно расширяет возможности метода — необязательно получать длинные донорские ДНК, чтобы заменить длинный участок генома.

Наконец, исследователи проверили, сможет ли прайм-сборка внедрить в геном полноразмерную кДНК гена дистрофина, мутации в котором связаны с мышечной дистрофией Дюшенна. Этот ген — привлекательная цель для терапии, но его большой размер вызывает проблемы. (Чтобы обойти их, для доставки используют два вирусных вектора с последующим белковым сплайсингом или доставляют «сокращенную» версию гена.) В экспериментах на клетках последовательность кДНК гена DMD длиной 11,3 т.п.н. вставилась в локус-мишень с достаточно высокой эффективностью и точностью. Еще более высокая эффективность была достигнута с геном химерного антигенного рецептора (CAR), специфичного к CD19 (размер гена — 2,4 т.п.н.).

Вставка последовательностей, сопоставимых по длине с генами, позволяет корректировать множество различных мутаций с помощью одной и той же редактирующей конструкции. Многие генетические заболевания вызываются различными мутациями в одном гене, и до сих пор для каждой мутации приходится создавать свой редактор. Замена обширного участка гена или целого гена могла бы стать альтернативой.

Точные механизмы синтеза и репарации ДНК, лежащие в основе прайм-сборки, еще предстоит определить, отмечают авторы. Вероятно, в них участвуют клеточные ДНК-полимеразы, но для их идентификации нужны дополнительные исследования.

В перспективе исследовательская группа планирует оценить эффективность, специфичность и безопасность прайм-сборки на животных моделях. Для доставки донорской ДНК и компонентов генного редактора in vivo, скорее всего, будут использоваться липидные наночастицы или аденоассоциированные вирусы (ААВ) — те и другие уже получили широкое распространение, что создает предпосылки для более легкого внедрения в клиническую практику.

Мышам с миодистрофией Дюшенна доставили полноразмерный дистрофин с помощью белкового транс-сплайсинга