Двойное праймированное редактирование генома работает аккуратнее CRISPR-Cas9

Команда из Института Бродов (США) предложила вариацию метода праймированного редактирования генома с использованием не одной, а двух гидовых РНК. Они отжигаются на две комплементарные цепи ДНК в участках, фланкирующих последовательность-мишень. Преимущества метода — минимальное количество нежелательных инсерций и делеций по сравнению с классическим CRISPR-Cas9 и возможность редактирования длинных последовательностей.

Credit:
vchalup | 123rf.com

Метод праймированного редактирования генома (prime editing) — модификация системы CRISPR-Cas9, позволяющая вносить изменения без двухцепочечного разрыва. Метод использует каталитически ослабленную никазу Cas9, сшитую с обратной транскриптазой. Никаза вносит одноцепочечный разрыв в сайт-мишень, а затем на матрице модифицированной гидовой РНК происходит синтез ДНК с желаемыми модификациями. Метод хорошо подходит для коротких инсерций и делеций (десятки п. о.), однако до сих пор невозможно было достаточно эффективно редактировать последовательности размером с типичный экзон. Авторы праймированного редактирования — команда из института Бродов под руководством профессора Дэвида Лю — предложили новую модификацию метода праймированного редактирования twinPE, которая преодолевает это ограничение.

Метод twinPE работает следующим образом. В клетку вводятся плазмиды, несущие последовательности двух гидовых РНК для праймированного редактирования (pegRNA), никазу Cas9 и обратную транскриптазу. Гидовые РНК связываются с ДНК с двух сторон от участка-мишени. Один участок pegRNA узнает одну цепь ДНК, и происходит разрезание комплементарной цепи. С этой цепью связывается второй участок той же pegRNA, частично ей комплементарный, и на ее основе обратная транскриптаза синтезирует ДНК, содержащую замену. То же самое происходит в сайте связывания второй pegRNA. Гидовые РНК подбираются таким образом, чтобы новые участки ДНК, синтезированные на их основе, были частично комплементарны. Эти участки ДНК отжигаются друг на друга. Далее фрагмент исходной цепи, содержащий свободные 5`-концы, вырезается.

Нужно отметить, что ранее уже были предложены методы с использованием пары pegRNA, но они были направлены исключительно на внесение либо делеций, либо небольших замен.

Исследователи применили новый метод для замены последовательности в 90 пар нуклеотидов на 38-нуклеотидную последовательность в клетках HEK293T и достигли эффективности 80%. Эффективность редактирования при внесении более длинной последовательности — 108 пар нуклеотидов — вместо 90-нуклеотидной составила 18%. Это в 20 раз превосходит эффективность внесения той же последовательности с использованием исходного метода праймированного редактирования.

При удалении последовательности длиной 780 пар нуклеотидов, содержащую экзон 51 гена DMD, была достигнута эффективность 28%. Это ниже, чем при использовании классического CRISPR-Cas9, но точность редактирования при этом была значительно выше: лишь в 5,1% случаев наблюдались нецелевые инсерции и делеции, по сравнению с 45% в классическом CRISPR-Cas9.

Задачу вставки больших фрагментов ДНК в геном авторы решили, добавив к twinPE интегразу (сайт-специфическую рекомбиназу) Bxb1. Ранее было показано, что Bxb1 обеспечивает интеграцию последовательности в геном между сайтами attP и attB. Сайт attP интегрировали в последовательность pegRNA, attB — пришили к фрагменту-вставке. С помощью такой системы ученым удалось достичь инверсии последовательности длиной 40 т. п. о.

Двойное праймированное редактирование twinPE объединяет в себе точность метода праймированного редактирования и высокую эффективность, которая стремится к эффективности классического CRISPR-Cas9.

Источник

Anzalone, A.V. et al. Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. // Nature Biotechnology, published 9 December 2021; DOI: 10.1038/s41587-021-01133-w

Добавить в избранное

Вам будет интересно