Корейские ученые записали изменения температуры в последовательность ДНК

Помимо широко распространенных методов для синтеза ДНК на одной матричной нити, разрабатываются технологии синтеза последовательности ДНК, который программируется иными способами. В качестве строительных блоков могут использоваться отдельные нуклеотиды, которые присоединяет терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT). Некоторые методы используют ДНК-полимеразу, а в качестве матриц — последовательно добавляемые кольцевые или шпилечные ДНК, которые кодируют разные фрагменты последовательности. Но очевидно, что в этом случае для синтеза ДНК необходимо последовательно добавлять нужные матрицы (авторы называют их «строительными блоками») и удалять ненужные: в одном объеме может синтезироваться только повторяющаяся последовательность. Для смены состава среды необходима сложная и дорогостоящая аппаратура.

Программируемая платформа для синтеза ДНК под названием TEMPER (TEmperature Mediated Primer Exchange Reaction — опосредованная температурой реакция обмена праймерами), которую предложили исследователи из научных центров и компаний Южной Кореи, управляется изменениями температуры. Иначе говоря, для проведения реакции достаточно термоциклера.

Функцию термочувствительных строительных блоков выполняют шпилечные ДНК (однонитевые ДНК с комплементарными последовательностями, образующими двунитевой участок). С однонитевым концом шпильки может гибридизоваться праймер, причем благодаря специальному дизайну последовательности гибридизация с каждой шпилькой происходит при своей температуре (более длинный сайт гибридизации соответствует более высоким температурам). После гибридизации праймера ДНК-полимераза удлиняет цепь, пока не достигнет стоп-последовательности у конца двунитевого участка, прекращающей синтез. Но диссоциация (отсоединение) продукта от шпильки-матрицы может произойти тоже лишь при определенной температуре, более низкой, чем температура посадки праймера (при таких температурах шпилька полностью сворачивается). В результате каждая шпилька работает только в определенном температурном диапазоне: за его пределами или продукт не может покинуть матрицу, или праймер диссоциирует от матрицы. Следовательно, если поместить в одну пробирке несколько типов шпилечных матриц, можно синтезировать желаемые последовательности ДНК, изменяя только температуру среды.

 Источник: Пресс-релиз

На рисунке показан синтез трех типов ДНК, меченных флуоресцентными зондами: каждый избирательно синтезируется при «своей» температуре. Но TEMPER разработан таким образом, что удлиненные продукты каждого этапа синтеза могли служить затравками для последующих этапов, что позволяет получать длинные молекулы с желаемой последовательностью участков. Можно ожидать, что синтез ДНК в обычном термоциклере значительно сократит стоимость и время, необходимые для синтеза, и снизит барьеры для входа не только в синтетическую биологию и генетические исследования, но и в биоиндустрию, включая разработку лекарств и прецизионную медицину, предполагают авторы пресс-релиза.

Для демонстрации практической применимости технологии авторы статьи также разработала энергонезависимый «черный ящик» для измерения температуры на основе ДНК, который работает в обратном направлении — отражает колебания температуры в нуклеотидной последовательности.

Активная часть прибора — это ДНК, которая обычно хранится в лиофилизированном состоянии и начинает работать при добавлении минимального количества воды. Синтезируются молекулы ДНК, и в них последовательность и количество участков, кодируемых той или иной шпилькой, определяется тем, когда, как долго и в каком порядке изменяется температура. (В эксперименте использовались три шпильки-индикатора — для обнаружения температур 30, 40 и 50°C и выше, а также шпильки-коннекторы, кодирующие участки для соединения фрагментов в одну молекулу ДНК — «регистратор данных».)

Это устройство способно, например, отслеживать температурный режим во время транспортировки продуктов в системе холодовой цепи — лекарственных препаратов или продуктов питания. Устройство снабжено индикатором, который меняет цвет за счет добавления колориметрических красителей, чувствительных к продуктам синтеза ДНК. Таким образом, критическое изменение температуры будет заметно для невооруженного глаза, еще до считывания данных с помощью секвенирования ДНК.

Хотя скорость записи и плотность битов у предложенного прототипа для индикации и регистрации температуры ниже, чем у известных методов, авторы считают, что простота реакционной системы и низкая себестоимость (по их оценкам, около 1 доллара) повысят ее доступность и масштабируемость. Дополнительными преимуществами являются энергонезависимость, широкий температурный диапазон и визуальная детекция. Более сложный и масштабируемый программируемый синтез ДНК, по их мнению, может быть достигнут на мультиплексном TEMPER-микрочипе с пространственным контролем температуры.

Как сообщается в разделе «Материалы и методы», олигонуклеотиды для этого исследования синтезировали традиционными методами южнокорейская компания Macrogen и американская Integrated DNA Technologies.

Запись ДНК на ленту кассеты — новый формат хранения данных